多花黑麦草品种DUS测试数量性状分级分析.docx
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多花黑麦草品种DUS测试数量性状分级分析
多花黑麦草品种DUS测试数量性状分级分析
刘欢1，马啸1，张新全1，张瑞珍2，陈诚1，唐露1，杨忠富1
（1.四川农业大学草业科学系，四川成都611130；2.四川省草原工作总站，成都610041）
摘要：
对多花黑麦草（LoliummultiflorumLam.）7个品种进行了不同时期30个数量性状指标的测定，利用数量性状对多花黑麦草性状进行了概率分级的研究，并进行了相关性分析。
结果表明，30个数量性状变异范围在7.55%~40.65%之间，变异系数最大的是分蘖数，最小的是千粒重。
根据各数量性状的K-S检验及χ2检验，发现仅少部分性状不符合χ2分布；最终将28个数量性状分为5个等级，另外将抽穗期（春化后）和分蘖数分为3个等级。
多花黑麦草的30个数量性状之间相关性分析结果表明株高与生长习性、小穗数与小穗密度、上部节间长与节间数呈极显著负相关，花序长与小穗密度呈极显著正相关。
研究结果为多花黑麦草品种的鉴定评价、品种选育及数量性状的分级提供了理论依据。
关键词：
多花黑麦草；DUS测试；数量性状；分级分析
ClassificationAnalysisforItalianRyegrassDUSTestingQuantitativeTraits
LIUHuan1,MAXiao1,ZHANGXin-quan1,ZHANGRui-zhen2,CHENCheng1,TANGLu1,YANGZhong-fu1
（1.DepartmentofGrasslandScience,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,Sichuan;2.GrasslandStationofSichuanProvince,Chengdu610041）
Abstract:
Quantitativetraitsof7Italianryegrassvarietiesweremeasuredindifferentgrowthperiodsandcorrelationof30quantitativetraitswereanalyzed.Theresultsshowedthatcoefficientofvariationofthe30quantitativetraitsaccessionsvariedfrom7.55%to40.65%,andthevariationcoefficientoftillernumberwasthebiggest,whilethevariationcoefficientofthousandseedweightwastheleast.AccordingtothequantitativetraitsofK-Stestandchi-squaretest,onlyasmallnumberofpropertiesdidnotconformtothechi-squaredistribution;finally,the28quantitativetraitscouldbedividedinto5grades,butthetimeofinflorescenceemergenceandthetillernumbercouldbedividedinto3grades.Thecorrelationanalysisof30quantitativetraitsindicatedthattheheightandthevegetativegrowthhabit,thenumberofspikeletandthedensityofspikelet,andthelengthofupperinternodeandthenumberofinternodewereallshowedhighlysignificantnegativecorrelation,whilethelengthofinflorescenceandthespikeletdensitywereshowedhighlysignificantpositivecorrelation.Theseresultscanprovidebasicinformationforvarietyidentification,breeding,andquantitativetraitsclassificationofItalianryegrass.
Keywords:
Italianryegrass;DUStesting;quantitativetraits;classificationanalysis
随着对知识产权保护的逐步重视，为了保护育种家的合法权益，我国于1997年3月20日颁布了《中华人民共和国植物新品种保护条例》，并于1999年4月23日正式加入国际植物新品种保护联盟（InternationalUnionfortheProtectionofNewVarietiesofPlants,UPOV），成为第39个成员国，植物新品种保护条例正式在中国实施[1]。
多花黑麦草（LoliummultiflorumLam.）是禾本科黑麦草属（LoliumL.）的一年生草本植物[2]，是世界上广泛栽培的优良牧草之一，适合生长在气候温和而湿润的地区，主要用于人工草地、割草地的建植和放牧利用中[3-4]。
我国从20世纪30年代开始研究多花黑麦草，到2014年为止，全国草品种审定登记的多花黑麦草品种16个。
其中引进品种11个，育成品种4个，属内杂交品种1个[5-6]。
植物新品种特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）测试（简称DUS测试）指南，是指新品种申报审查时判定测试品种是否为新品种的过程，为新品种的授权提供了可靠的技术支持和判定依据[7]。
DUS测试指南既是指导研究单位科学准确开展DUS测试工作的技术手册，也是审批机构开展新品种DUS审查的技术标准[8]。
根据黑麦草自身形态特征，按照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T/19557.1-2004）的相关原则，参考UPOV《特异性、一致性和稳定性测试指南-黑麦草》（UPOVTG/4/8）[9]、《特异性、一致性和稳定性测试方案》（CPOV-TP/004/1）[10]和《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试及统一描述总则》（UPOVTG/1/3）[11]，结合田间种植试验的观测结果与室内试验分析，初步提出了我国黑麦草测试指南[12]。
但在所有黑麦草DUS测试指南中，虽然数量性状的不同表达状态都列出了所对应的标准品种，但没有同时列出相应的分级范围，而且根据标准品种进行等级划分的划分方式主观性太强，无法客观的评价及划分黑麦草新品种性状的等级。
目前国内对黑麦草研究主要集中在品种的生产性能和性状的综合评价、冬闲田种草等方面[13-16]，但少见多花黑麦草品种的DUS测试保护品种产权报道，特别是DUS测试性状的等级划分未见报道。
本试验主要根据日本的《黑麦草亚种DUS测试指南》（イタリアンライグラス亜種/Italianryegrass）[17]和我国的《黑麦草DUS测试指南》，参照国际植物新品种保护联盟（UPOVTG/4/8）[9]和欧盟植物保护联盟制定的（CPOV）[10]测试指南，采用单株测定的方式，以7个多花黑麦草国审标准品种为研究对象，对多花黑麦草的30个数量性状进行了分级研究，并对30个数量性状进行相关性分析和多样性分析，旨在明确多花黑麦草数量性状的分布类型，并建立其概率分级指标体系，以期为多花黑麦草种质资源的综合评价和利用提供参考，为多花黑麦草新品种的DUS测试的开展提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料种植地概况
本试验材料种植于四川省雅安市四川农业大学草学系雅安基地（N30°08′,E103°14′）。
海拔600m，日照偏少，湿度较大，平均年日照时数为1019h，年日照率为23%，年平均湿度为79%；无霜期280~300d，年降雨量1700mm，年均雨日达210d；蒸发量年平均为838.8mm；属于亚热带湿润季风气候,平均气温16.7℃,极端高温37.7℃,极端低温-3℃，最热月（7月）均温25.3℃，最冷月（1月）均温6.1℃，紫色土，熟化程度高，土壤深厚肥沃，pH在4~6.5之间，有机质含量1.46%，土壤速效N、P、K含量分别为100.63，4.73，338.24mg/kg。
该地气候温和湿润，是具有代表性的四川盆地丘陵平原气候地区之一，适合各种牧草的种植[18-19]。
1.2供试材料
供试材料为我国多花黑麦草的7个审定品种，其中6个引进品种，1个育成品种（表1），均由四川农业大学草业科学系收集而来。
表1参试多花黑麦草品种（系）材料信息
Table1InformationofthetestedItalianryegrassmaterials
编号
品种
拉丁名
种子来源
品种类型
No.
Variety
Latin Name
SeedSource
VarietyType
1
特高德
L.multiflorum.cv.Tetragold
百绿集团BARENBRUG
引进品种Theintroduced varieties
2
长江2号
L.multiflorum.cv.ChangjiangNo.2
四川农业大学SichuanAgriculturalUniversity
育成品种Thebredvarieties
3
赣选1号
L.multiflorum.cv.GanxuanNo.1
江西省畜牧技术推广站JiangxilivestocktechnologiespopularizingStation
引进品种Theintroduced varieties
4
阿伯德
L.multiflorum.cv.Aubade
FF公司FFCompany
引进品种Theintroduced varieties
5
达伯瑞
L.multiflorum.cv.'DoubleBarrel'
丹农种子公司DLF-TRIFOLIUM
引进品种Theintroduced varieties
6
邦德
L.multiflorum.cv.Abundant
丹农种子公司DLF-TRIFOLIUM
引进品种Theintroduced varieties
7
杰威
L.multiflorum.cv.Splendor
丹农种子公司DLF-TRIFOLIUM
引进品种Theintroduced varieties
1.3试验材料种植及管理
将各品种的种子置于盆钵中发芽，根据不同的天气情况1~2天浇水1次，避免幼苗缺水死亡，待幼苗长至4~5片叶龄，再移栽到试验地点种植。
移栽前，需对土地进行人工翻耕、除杂，翻耕深度为25~30cm，耕后将土块耙平碾碎，平整后间以排水沟，便于排水；移栽前施适量基肥，基肥为充分腐熟的人畜粪尿。
本试验中采取单因素随机区组设计，种植方式为单株种植，每个品种种植90株，设置3个重复，株行距为50cm×100cm。
移栽后进行统一管理，及时浇水施肥和中耕除草，以保证植株正常生长发育。
1.4观测指标
本试验所有指标均以单株为单位测量，在多花黑麦草整个生育期进行观测。
共调查了30个数量性状（表2），主要结合了国际植物新品种保护联盟在2006年制定的《特异性、一致性和稳定性测试指南-黑麦草》（UPOVTG/4/8）和《日本黑麦草亚种DUS测试指南》，对不同时期（表3）的不同性状进行了观测与记录。
观测时，每个品种从90个单株中随机选取长势一致的60个单株，每株选取5个分蘖测定。
叶长、叶宽等性状利用卷尺和电子游标卡尺等工具进行测量；SPAD（SoilandPlantAnalyzerDevelopment）值数据采用SPAD-502叶绿素含量测定仪测定，测定时每枝分蘖选取旗叶和倒二叶上不同的三处进行测定，计算其平均值作为该分蘖枝的数据进行记录。
1.5数据统计及分析
1.5.1数量性状的分级
利用Excel2013对各数量性状的最大值、最小值、平均值、中值和平均标准差等进行统计，然后对性状数据分布进行正态性检验，主要是采用单样本K-S（Kolmogorov-Smirnov）检验法[20]和卡方（χ2）检验法[21]，判断其分布是否符合正态分布或卡方分布。
对符合正态分布的性状，参考UPOV的分级并结合性状的实测数据，将其分为5级或3级，分级标准的设定按照刘平[22]、刘孟军[23]、杨俊霞等[24]的分级方法，5级中1~5级出现的概率分别为10%、20%、40%、20%和10%，3级中1~3级出现的概率分别为30%、40%和30%，采用（
-1.2818S）、（
-0.5246S）、（
+0.5246S）、（
+1.2818S）4个分点来分为5级，或用（
-0.5246S）和（
+0.5246S）2个分点分为3级。
分级后再统计各性状取值的分布直方图，用分布函数的卡方（χ2）检验法检验各性状频数的分布是否为正态分布类型。
对于不符合正态分布的性状，采用刘平等[22]在分组的基础上，极差按0.5~1倍标准差来进行调整，使分布于各组的频数符合卡方分布。
1.5.2数量性状的相关性分析
用SPSS22.0软件计算各数量性状的相关系数。
1.5.3数量性状的多样性分析
多花黑麦草的各性状参考UPOV《特异性、一致性和稳定性测试指南-黑麦草》（UPOVTG/4/8）列出的表达状态，具体划分等级按照表7确定的分级标准确定；对于每个品种，单个性状中表达的状态所对应的级别分别标记为AA（等级1）、BB（等级3）、CC（等级5）、DD（等级7）、EE（等级9），由此构建成形态性状的原始数据矩阵，对于品种群体，在某一性状中出现的级别的总数，标记为该性状的等位变异数目（Na），采用PopGen32软件，分析不同性状的等位变异数目、有效等位变异数目（Ne）和Shannon-Weaver多样性指数。
Shannon-Weaver多样性指数计算公式[25]为：
H'=-ΣPiln（Pi），式中Pi为某个性状第i个代码出现的概率。
1.5.4聚类分析
将性状数据标准化处理后，采用多变量分析系统NTSYSpc2.10统计软件中的SM法计算遗传相似系数，然后根据相似系数用SAHNClustering和非加权成对算术平均法（UPGMA，unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean）进行聚类分析[26]。
表2测试性状及观测办法
Table2Testedcharacteristicsandmethods
代码
性状
观测方法
代码
性状
观测方法
Code.
Characteristics
Surveymethod
Code.
Characteristics
Surveymethod
C1
*种子千粒重
C16
*花序长
60-68
Seed:
weightof1000seeds
（g）
Inflorescence:
length
（cm）
C2
∗叶长（营养生长阶段）
20-29
C17
*小穗数
60-68
Leaf:
length（atvegetativestage）
（cm）
Inflorescence:
numberofspikelet
（个）
C3
*叶宽（营养生长阶段）
20-29
C18
*小穗密度（每个小穗着生长度）
60-68
Leaf:
width（atvegetativestage）
（mm）
Inflorescence:
density（dividingcharacteristic16bycharacteristic17）
C4
*叶色（营养生长阶段）
20-29
C19
*外颖长
60-68
Leaf:
intensityofgreencolor
Inflorescence:
lengthofouterglumeonbasalspikelet
（mm）
C5
*株幅（春化后）
30
C20
*基部小穗长（不包括芒）
60-68
Plant:
width（aftervernalization）
（cm）
Inflorescence:
lengthofbasalspikeletexcludingawn
（mm）
C6
*生长习性（春化后）
30-39
C21
+开花期株高
60-68
Plant:
vegetativegrowthhabit（aftervernalization）
Plant:
heightatinflorescence
（cm）
C7
*株高（春化后）
30-39
C22
+开花期株幅
60-68
Plant:
height（aftervernalization）
（cm）
Plant:
widthatinflorescence
（cm）
C8
*孕穗期（春化后）
50
C23
+开花期旗叶长
60-68
Plant:
timeofinflorescenceemergence（aftervernalization）
（d）
Flagleaf:
lengthatinflorescence
（cm）
C9
*孕穗期株高
50
C24
+开花期旗叶宽
60-68
Plant:
naturalheightatinflorescenceemergence
（cm）
Flagleaf:
widthatinflorescence
（mm）
C10
*孕穗期株幅
50
C25
+小花数
60-68
Plant:
widthatinflorescenceemergence
（cm）
Spikelet:
numberofflorets
（个）
C11
*孕穗期旗叶长
50
C26
+分蘖数
60-68
Flagleaf:
lengthatinflorescenceemergence
（cm）
Plant:
numberoftillers
（个）
C12
*孕穗期旗叶宽
50
C27
+节间数
60-68
Flagleaf:
widthatinflorescenceemergence
（mm）
Numberofinternode
（个）
C13
*旗叶长宽比
50
C28
+单株鲜重
60-68
Flagleaf:
length/widthratio
The fresh weight of eachplant
（g）
C14
*最长茎秆：
长度（包括花序）
60-68
C29
+单株干重
60-68
Plant:
lengthoflongeststem,inflorescenceincluded（whenfullyexpanded）
（cm）
The dry weight of eachplant
（g）
C15
*穗下茎节长度
60-68
C30
+SPAD值
60-68
Plant:
lengthofupperinternode
（cm）
SPADvalues
∗：
UPOV规定须统一描述的重要性状；＋：
非指南性状
Asteriskedcharacteristics（denotedby*）arethoseimportantforthevarietydescriptionandshouldalwaysbeexaminedforDUSbyallmembersoftheUPOV.Characteristics（denotedby+）arethosedidn'tincludedintheTestGuidelines
表3多花黑麦草生育期阶段表
Table3ThegrowthperiodofItalianryegrassstage
名称
编号
描述
Name
No.
Description
营养生长时期
DC10
第1叶从胚芽鞘长出
Firstleafthroughcoleoptile
Seedlinggrowth（seedling:
oneshoot）
DC15
第5叶展开
Fiveleavesunfolded
DC19
9片及以上叶展开
Nineormoreleavesunfolded
分蘖期
DC20
仅有主茎
Mainshootonly（beginningoftillering）
Tillering
DC23
主茎和3个分蘖
Mainshootand3tillers
DC25
主茎和5个分蘖
Mainshootand5tillers
DC29
主茎和9个分蘖以上
Mainshootand9ormoretillers
拔节期
DC30
假茎直立
Pseudo-stemerection（formedbysheathsofleaves）.
Stemelongation
DC31
第1节出现
Firstnodedetectable（earlystemextensionacrossallstems）
DC35
第5节出现
Fifthnodedetectable（50%extensionacrossallstems）
DC39
旗叶叶舌可见
Flagleafligula/collarjustvisible（pre-bootstage）
孕穗期
DC41
旗叶叶鞘伸展
Flagleafsheathextending（littleenlargementofthe
Booting
inflorescence,earlyboot-stage）
DC45
穗苞开始膨大
Bootsswollen（late-bootstage）
DC47
第一叶鞘张开
Firstleafsheathopening
DC49
芒或穗顶端可见
firstawnsvisible（inawnedformsonly）
抽穗期
DC50
刚可见花序第1小穗
Firstspikeletofinflorescencejustvi
升级会员 