整理生物技术生物化学实验讲义.docx

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整理生物技术生物化学实验讲义

实验一糖的呈色反应和还原糖的检验

一、实验目的

1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。

2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。

二、实验原理

糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。

戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。

这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。

与一元酚如α一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。

与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：

通常使用的无机酸为硫酸。

如用盐酸，则必须加热。

常用的酚类为α一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。

有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式；

（一）糖的呈色反应

1．Molish反应（α～萘酚反应）

本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。

糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α一萘酚作用，形成红紫色复合物。

在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。

自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。

此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。

因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。

2．蒽酮反应

糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10一酮一9，10一二氢蒽）反应生成蓝一绿色复合物。

3.Seliwanoff反应（间苯二酚反应）

　该反应是鉴定酮糖的特殊反应。

在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。

后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s。

在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢。

只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。

蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。

4．Bial反应（甲基间苯二酚反应）

戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚（地衣酚）缩合，形成深蓝色的沉淀物。

此沉淀物溶于正丁醇。

己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。

（二）还原糖的鉴定

含有自由醛基（一CHO）或酮基（>C==O）的单糖和二糖为还原糖。

在碱性溶液中，还原糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。

1．Fehling反应

费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。

硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。

若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

上述反应可用下列方程式表示：

在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。

也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。

由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。

为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。

平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。

费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。

2.Benedict反应

Benedict试剂是Fehling试剂的改良。

它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。

3．Barfoed反应

该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。

在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。

单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。

所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。

当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10min内水解而发生反应。

还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。

三、实验试剂和材料仪器

1.测试糖液

2％阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，1％淀粉溶液和2种未知糖液。

2.试剂

①Molish氏试剂

称取α－萘酚2克，溶于95％乙醇中并定容到100ml。

注意临用前，新鲜配制，贮于棕色瓶中。

②蒽酮（Anthrone）试剂

溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸（A.R．，比重1.84，含量95%）中。

当日配制、使用。

③Fehling氏试剂

试剂A：

将34.5g硫酸铜（CuSO4·5H20）溶于500mI。

蒸馏水中。

试剂B：

将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，储于带橡皮塞瓶中。

临用时，将试剂A和B等量混合。

④Benedict氏试剂

溶解85g柠檬酸钠（Na3C6HO，·llH20）及50g无水碳酸钠于400mI。

水中；另溶8.5g硫酸铜于50mL。

热水中。

将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀，可过滤．本试剂可长期使用。

如放置过久，出现沉淀．可取用其上清液。

⑤Bial氏试剂

溶解1.5g地衣酚（orcin01）于500mL，浓盐酸并加20—30滴10％三氯化铁溶液。

⑥Seliwanoff氏试剂

溶解50mg问苯二酚（resorcin01）于100rnl．，盐酸（盐酸：

水=1:

2V／V）中。

临用前配制。

盐酸浓度不宜超过12％，否则，它将导致糖形成糠醛或其衍生物。

⑦浓硫酸。

3.器材

试管，试管架，煤气灯和沸水浴等。

四、实验方法

（一）.糖的呈色反应

1．Molish反应

取8支已标号的试管，分别加入各种测试糖液lmL（约15滴），再各加入Molish试剂2滴，摇匀。

逐一将试管倾斜，分别沿管壁慢慢加入浓硫酸lmL，然后，小心竖直试管，使糖液和硫酸清楚地分为两层，观察交界处颜色变化。

如几分钟内无呈色反应，可在热水浴中温热几分钟。

记录各管出现的颜色，说明原因，检定未知糖液。

2．蒽酮反应

取8支标号的试管，分别加入lmL蒽酮溶液，再将测试糖液分别滴加到各试管内，混匀，观察颜色变化，鉴定未知糖液。

3．Seliwanoff反应

取试管8支，编号，各加人Seliwanoff试剂ImL。

再依次分别加入测试糖液各4滴，混匀，同时放人沸水浴中，比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序，分析说明原因。

注意

蔗糖的反应。

4.bial反应

将2滴测试糖液加到装有1mlBial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.

如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应。

（二）还原糖的鉴定

1．Fehling反应

取8支试管，各加Fehling试剂A和B各lmL。

摇匀后，分别加人测试糖液各4滴，沸水浴煮2—3min，取出冷却，观察沉淀和颜色的变化。

2.Benedict反应

于8支试管中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.

3.barfoed反应

分别加入测试糖液2-3滴到含有1mlBarfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.

五、注意事项

1.Molisch反应非常灵敏，0．001％葡萄糖和0．0001％蔗糖即能呈现阳性反应。

因此，不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。

过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色。

需稀释糖溶液后重做。

2.果糖在Seliwanoff。

试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色。

戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合。

生成绿色到蓝色产物。

3.酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用。

4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。

反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。

有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀。

实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可能略有不同。

溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别。

5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。

应注意观察试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。

六、思考题

1．列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用。

2．应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题?

3．举例说明哪些糖属于还原糖。

4．运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。

5．牛乳中含有5％双糖。

如何证明牛乳中有双糖存在?

这种双糖是什么糖?

请选用一些颜色反应来加以鉴定。

实验二3，5－二硝基水杨酸比色定糖法

一、目的和要求

1.掌握3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。

2.掌握分光光度计的使用方法。

二、721分光光度计的使用

分光分析原理

有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。

有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。

吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。

分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert-Beer定律。

（一）Lambert定律当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度（C）不变则液层的厚度（L）愈大，光线强度的减弱也愈显著。

若C不变，OD∝L

（二）Beer定律当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。

若L不变：

OD∝C

（三）Lambert-Beer定律及其应用

1．Lambert-Beer定律：

当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。

其关系式如下：

两边取对数得：

lgT=–KCL

图6一束单色光通过溶液时的情况示意图

式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，

L为液层的厚度。

K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关。

若将用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示），则它们之间的关系如下：

2．待测溶液浓度的计算：

根据Lambert-Beer定律标准溶液：

ODs=KsCsLs

待测溶液：

ODu=KuCuLu

当两种溶液的液层厚度相等（Lu=Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。

两式相比得：

即：

721E型分光光度计的操作

这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。

其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好。

使用方法如下：

1.转动波长选择钮，选用所需的波长。

2.接通电源（指示灯亮），打开电源开关。

3.将机器预热20分钟。

4.按动“Mode”键，模式转换到“T”模式。

5.拉动比色皿座的拉杆半格，使隔板正好档住光路，按“0％T”按钮调0，然后将拉杆推回。

6.按“100％T”按钮调节“100％T”，此时显示屏出现“BLA”字样，闪烁几秒后出现“100.0”,调节完毕。

⒎将比色皿放入，空白对照放入第一格，重复步骤六以后，将模式转化为“A“模式，测定溶液的吸光度。

做标准曲线时从低浓度往高浓度过渡时不需要用蒸馏水润洗比色皿。

⒏比色完毕后，关上电源开关，取出比色皿，将比色皿暗箱盖好，清洗比色皿并晾干。

三、3，5-二硝基水杨酸比色定糖

实验原理

糖的测定方法有物理和化学两类。

由于化学方法比较准确，常常使用之。

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有醛基和酮基的糖类。

在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色强度成一定的比例关系，在550nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。

该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。

操作方法

一、葡萄糖标准曲线的制定

取6支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：

表6葡萄糖标准曲线的制作

管号项目

空白

1

2

3

4

5

标准糖溶液（mL）

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

蒸馏水（mL）

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

DNS（mL）

3

3

3

3

3

3

煮沸10分钟，用水冷却

加蒸馏水（mL）

16

16

16

16

16

16

吹吸均匀

光密度（OD）

将上述各管溶液混匀后，在721分光光度计上用550纳米进行比色测定，用空白管溶液调零点。

记录光吸收值。

以葡萄糖浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制出标准曲线。

二、样品中还原糖含量的测定

1.样品中还原糖的提取：

准确称取新鲜苹果（去皮）1.0克，加少量蒸馏水于研钵中研磨，加蒸馏水洗研钵并移至大试管，放入50℃恒温水浴中保温30分钟。

保温完毕先用纱布过滤。

再用滤纸过滤，移入100mL容量瓶中。

将上清液作为还原糖待测液。

或直接取适量浓度的未知糖溶液进行测定。

2.样品中总糖的水解及提取

准确称取1克淀粉放入大试管中，加6mol/L的盐酸10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h后，取出1～2滴，用碘－碘化钾溶液检查水解是否完全，若已完全，则不出现蓝色。

水解毕冷却至室温后用6mol/L的NaOH调pH至中性，并定容至100mL，过滤，取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

3.样品中含糖量的测定

分别吸取两种待测液各1mL（作平行对照），按标准曲线制作方法精确加入各种试剂，将各管混匀后，测定各管的光密度，两管对照取平均值。

4.结果计算

在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出样品内还原糖的百分含量。

总糖（％）＝

×100

还原糖（％）＝

×100

试剂和器材

一、试剂

1.3，5-二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：

182g酒石酸钾钠（A.R.）溶于500mL热水中，在热溶液中依次加入3，5一二硝基水杨酸（C.P.）6.3g，2mol/L的NaOH溶液262mL，，再加5g结晶苯酚（A.R.）和5g亚硫酸钠（C.P.），搅拌溶解。

冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

2.碘－碘化钾溶液：

把20克碘化钾和10克碘溶于100mL水中，使用前，取1mL加水稀释到10mL。

3.0.1%葡萄糖标准液：

准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在105℃烘至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，冰箱保存备用。

二、器材

（1）试管和试管架。

（2）吸量管（1毫升和2毫升）。

（3）容量瓶（100毫升）（4）恒温水浴锅

（5）721分光光度计

讨论

●DNS溶液配制的时候为什么要加入氢氧化钠、苯酚等试剂？

●DNS反应时为何要过量？

实验三蛋白质和氨基酸的呈色反应

一、目的要求

（1）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

（2）学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。

二、原理

㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法

蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。

1．双缩眠反应

当脲（即尿素）加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲（biuret）。

然后在碱性溶液中与铜离子（cu2+）结合生成复杂的紫红色化合物。

这一呈色反应称为双缩脲反应。

紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。

应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。

2．Salkowski（1888）蛋白黄色反应

它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。

苯丙氨酸和苯

反应很困难。

皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。

硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。

参考反应是：

3．茚三酮反应

蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。

除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色

外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。

三、器材与试剂

㈠器材

⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管

㈡试剂和材料

⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3

⒌卵清蛋白溶液（蛋清：

水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液

四、操作步骤

1.双缩脲反应

（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。

试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。

（2）另取一支试管，加卵清蛋白溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及1％CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

2.Salkowski（1888）蛋白黄色反应

（1）取一支试管，加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO33－4滴，加热，冷却后再加入10％NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

（2）取一支试管，用0.5％苯酚溶液代替蛋白质溶液，重复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。

（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。

3.茚三酮反应

（1）取2支试管分别加入卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加入0.5ml0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热1－2分钟，冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。

（2）在一块滤纸片上滴加1滴0.5％甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1％的茚三酮－乙醇溶液显色，用电吹风吹开显色。

观察出现的紫红色斑点。

五、实验记录

以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“＋”、“＋＋”和“＋＋＋”表明颜色深浅程度。

六、思考题”

1综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。

2．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。

能对此作何结论?

3．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?

若不是。

为什么?

4．是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果，为什么?

是否大部分蛋白质呈现阳性结果。

为什么?

实验四蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法

一、目的要求

学习考马斯亮蓝（CoomssieBrilliantB1ue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

二、原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理浓度的快速。

灵敏的方法。

考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式．红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔键（vsnderWaals’bond）结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量．

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质—染料复合物具有很高的消光系数．使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0．275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是1—10ug蛋白质。

此反应重复性好．精确度高，线性关系好．标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低．但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：

NaCl，KCl，MgC12，乙醇，（N4H）2S04无干扰．强碱缓冲剂在测定中有一些颜色于扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响．Tris，乙酸，2—巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX—100,SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。

三、试剂与器材

㈠试剂

1．考马斯亮蓝试剂

考马斯亮蓝G—250100mg溶于50mL95％乙醇中，加入100mL85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。

最终试剂中含0.01％（W/V）考马斯亮蓝G—250，4.7％（W/V）乙醇，8.5％（W/V）磷酸。

2．标准蛋白质溶液

结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg／mL蛋白溶液。

㈡测试样品

未知蛋白质溶液。

㈢器材

试管、试管架、移液管（5mL），微量取液器，721型分光光度计

四、操作方法

㈠标准法制定标准曲线

取14支试管．分两组按下表平行操作

表8考马斯亮蓝标准曲线制作方法

试管编号

0

1

2

3

4

5

6

1mg/ml标准蛋白溶液/ml

0

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.15mol/LNaCl/ml

0.10

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

考马斯亮蓝试剂/ml

5

摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色

A595nm

绘制标准曲线：

以595nm为纵坐标．标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

㈡测定未知样品蛋白质浓度

测定方法同上，通过一定的稀释方法，取合适的未知样品体积。

使其测定值在标准曲线的直线范围内。

根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

五、注意事项

（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5—20min血内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。

（2）测定中，蛋白—染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。

六、思考题

1.如果给定的蛋白质溶液浓度不在标准曲线的范围内，你应当采取什么的措施使其适用于考马斯亮蓝染色测定法?

2.测定蛋白质溶液浓度的方法还有哪些？

请列出三种以上。

实验五蛋白质的两性性质及等电点的测定

一、实验目的：

（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。

（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。

二、实验原理：

蛋白质是两性电解质。

蛋白质分子中可以解离的基团除N－端α－氨基与C－端α－羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带