整理生物技术生物化学实验讲义.docx
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整理生物技术生物化学实验讲义
实验一糖的呈色反应和还原糖的检验
一、实验目的
1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。
2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、实验原理
糖经浓无机酸处理,脱水产生糠醛或糠醛衍生物。
戊糖形成糠醛,己糖则形成羟甲基糠醛。
这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下,能与酚类化合物缩合生成有色物质。
与一元酚如α一萘酚作用,形成三芳香环甲基有色物质。
与多元酚如间苯二酚作用,则形成氧杂蒽有色物质,反应式如下:
通常使用的无机酸为硫酸。
如用盐酸,则必须加热。
常用的酚类为α一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等,有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。
有人认为,用浓硫酸作为脱水剂时,形成有颜色的产物与酚核的磺化有关,见如下反应式;
(一)糖的呈色反应
1.Molish反应(α~萘酚反应)
本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。
糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α一萘酚作用,形成红紫色复合物。
在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环,因此又称紫环反应。
自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。
此外,各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。
因此,阴性反应证明没有糖类物质的存在;而阳性反应,则说明有糖存在的可能性,需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
2.蒽酮反应
糖经浓酸水解,脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9,10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物。
3.Seliwanoff反应(间苯二酚反应)
该反应是鉴定酮糖的特殊反应。
在酸作用下,己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。
后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物,反应迅速,仅需20—30s。
在同样条件下,醛糖形成羟甲基糠醛较慢。
只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸,才给出微弱的阳性反应。
蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。
4.Bial反应(甲基间苯二酚反应)
戊糖与浓盐酸加热形成糠醛,在有Fe3+存在下,它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合,形成深蓝色的沉淀物。
此沉淀物溶于正丁醇。
己糖也能发生反应,但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。
(二)还原糖的鉴定
含有自由醛基(一CHO)或酮基(>C==O)的单糖和二糖为还原糖。
在碱性溶液中,还原糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原,糖本身被氧化成酸类化合物,此性质常用于检验糖的还原性,并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。
1.Fehling反应
费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。
硫酸铜与碱溶液混合加热,则生成黑色的氧化铜沉淀。
若同时有还原糖存在,则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
上述反应可用下列方程式表示:
在碱性条件下,糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。
也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。
由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用,因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。
为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀,Fehling试剂中加入酒石酸钾钠,它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子,该反应是可逆的。
平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。
费林试剂是一种弱的氧化剂,它不与酮和芳香醛发生反应。
2.Benedict反应
Benedict试剂是Fehling试剂的改良。
它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂,其碱性比Fehling试剂弱,灵敏度高,干扰因素少,因而在实际应用中有更多的优点。
3.Barfoed反应
该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。
在酸性溶液中,单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。
单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。
所以,该反应可用于区别单糖和还原二糖。
当加热时间过长,非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应,如蔗糖在10min内水解而发生反应。
还原二糖浓度过高时,也会很快呈现阳性反应,若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。
三、实验试剂和材料仪器
1.测试糖液
2%阿拉伯糖,葡萄糖,果糖,麦芽糖,蔗糖,1%淀粉溶液和2种未知糖液。
2.试剂
①Molish氏试剂
称取α-萘酚2克,溶于95%乙醇中并定容到100ml。
注意临用前,新鲜配制,贮于棕色瓶中。
②蒽酮(Anthrone)试剂
溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸(A.R.,比重1.84,含量95%)中。
当日配制、使用。
③Fehling氏试剂
试剂A:
将34.5g硫酸铜(CuSO4·5H20)溶于500mI。
蒸馏水中。
试剂B:
将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中,储于带橡皮塞瓶中。
临用时,将试剂A和B等量混合。
④Benedict氏试剂
溶解85g柠檬酸钠(Na3C6HO,·llH20)及50g无水碳酸钠于400mI。
水中;另溶8.5g硫酸铜于50mL。
热水中。
将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中,边加边搅,如有沉淀,可过滤.本试剂可长期使用。
如放置过久,出现沉淀.可取用其上清液。
⑤Bial氏试剂
溶解1.5g地衣酚(orcin01)于500mL,浓盐酸并加20—30滴10%三氯化铁溶液。
⑥Seliwanoff氏试剂
溶解50mg问苯二酚(resorcin01)于100rnl.,盐酸(盐酸:
水=1:
2V/V)中。
临用前配制。
盐酸浓度不宜超过12%,否则,它将导致糖形成糠醛或其衍生物。
⑦浓硫酸。
3.器材
试管,试管架,煤气灯和沸水浴等。
四、实验方法
(一).糖的呈色反应
1.Molish反应
取8支已标号的试管,分别加入各种测试糖液lmL(约15滴),再各加入Molish试剂2滴,摇匀。
逐一将试管倾斜,分别沿管壁慢慢加入浓硫酸lmL,然后,小心竖直试管,使糖液和硫酸清楚地分为两层,观察交界处颜色变化。
如几分钟内无呈色反应,可在热水浴中温热几分钟。
记录各管出现的颜色,说明原因,检定未知糖液。
2.蒽酮反应
取8支标号的试管,分别加入lmL蒽酮溶液,再将测试糖液分别滴加到各试管内,混匀,观察颜色变化,鉴定未知糖液。
3.Seliwanoff反应
取试管8支,编号,各加人Seliwanoff试剂ImL。
再依次分别加入测试糖液各4滴,混匀,同时放人沸水浴中,比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序,分析说明原因。
注意
蔗糖的反应。
4.bial反应
将2滴测试糖液加到装有1mlBial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.
如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应。
(二)还原糖的鉴定
1.Fehling反应
取8支试管,各加Fehling试剂A和B各lmL。
摇匀后,分别加人测试糖液各4滴,沸水浴煮2—3min,取出冷却,观察沉淀和颜色的变化。
2.Benedict反应
于8支试管中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.
3.barfoed反应
分别加入测试糖液2-3滴到含有1mlBarfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.
五、注意事项
1.Molisch反应非常灵敏,0.001%葡萄糖和0.0001%蔗糖即能呈现阳性反应。
因此,不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。
过浓的果糖溶液,由于硫酸对它的焦化作用,将呈现红色及褐色而不呈紫色。
需稀释糖溶液后重做。
2.果糖在Seliwanoff。
试剂中反应十分迅速,呈鲜红色,而葡萄糖所需时间长,且只能产生黄色至淡红色。
戊糖亦与Seliwanoff试剂反应,戊糖经酸脱水生成糠醛,与间苯二酚缩合。
生成绿色到蓝色产物。
3.酮基本身并没有还原性,只有在变为烯醇式后,才显示还原作用。
4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小,Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。
反应速度快时,生成的Cu2O颗粒较小,呈黄绿色;反应慢时,生成的Cu2O颗粒较大,呈红色。
有保护胶体存在时,常生成黄色沉淀。
实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒,因而每次观察到颜色可能略有不同。
溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计,而不能依据沉淀的颜色来区别。
5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部,溶液仍为深蓝色。
应注意观察试管底部红色的出现,它与一般还原性实验不相同,观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。
六、思考题
1.列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用。
2.应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时,应注意些什么问题?
3.举例说明哪些糖属于还原糖。
4.运用本实验的方法,设计一个鉴定未知糖的方案。
5.牛乳中含有5%双糖。
如何证明牛乳中有双糖存在?
这种双糖是什么糖?
请选用一些颜色反应来加以鉴定。
实验二3,5-二硝基水杨酸比色定糖法
一、目的和要求
1.掌握3,5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2.掌握分光光度计的使用方法。
二、721分光光度计的使用
分光分析原理
有色溶液对光线有选择性的吸收作用,不同物质由于其分子结构不同,对不同波长光线的吸收能力也不同,因此,每种物质都具有其特异的吸收光谱。
有些无色溶液,虽对可见光无吸收作用,但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。
分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度,其理论依据是Lambert-Beer定律。
(一)Lambert定律当一束单色光通过一均匀溶液时,由于溶液吸收一部分光能,使光的强度减弱,若溶液的浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大,光线强度的减弱也愈显著。
若C不变,OD∝L
(二)Beer定律当一束单色光通过一均匀溶液时,若液层的厚度不变,则溶液浓度愈高,光线强度的减弱也愈显著。
若L不变:
OD∝C
(三)Lambert-Beer定律及其应用
1.Lambert-Beer定律:
当一束单色光通过一均匀溶液时,该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。
其关系式如下:
两边取对数得:
lgT=–KCL
图6一束单色光通过溶液时的情况示意图
式中T为透光度,I0为入射光强度,I为透过光的强度,C为溶液的浓度,
L为液层的厚度。
K为常数,称为消光系数,其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关。
若将用光密度(OD)表示该溶液对光线吸收的情况(有的也用吸光度A表示),则它们之间的关系如下:
2.待测溶液浓度的计算:
根据Lambert-Beer定律标准溶液:
ODs=KsCsLs
待测溶液:
ODu=KuCuLu
当两种溶液的液层厚度相等(Lu=Ls)、温度相同、且波长也相同(相同物质的两种不同浓度)时,则Ku=Ks。
两式相比得:
即:
721E型分光光度计的操作
这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。
其波长范围为360-800nm,在410-710nm之间的灵敏度较好。
使用方法如下:
1.转动波长选择钮,选用所需的波长。
2.接通电源(指示灯亮),打开电源开关。
3.将机器预热20分钟。
4.按动“Mode”键,模式转换到“T”模式。
5.拉动比色皿座的拉杆半格,使隔板正好档住光路,按“0%T”按钮调0,然后将拉杆推回。
6.按“100%T”按钮调节“100%T”,此时显示屏出现“BLA”字样,闪烁几秒后出现“100.0”,调节完毕。
⒎将比色皿放入,空白对照放入第一格,重复步骤六以后,将模式转化为“A“模式,测定溶液的吸光度。
做标准曲线时从低浓度往高浓度过渡时不需要用蒸馏水润洗比色皿。
⒏比色完毕后,关上电源开关,取出比色皿,将比色皿暗箱盖好,清洗比色皿并晾干。
三、3,5-二硝基水杨酸比色定糖
实验原理
糖的测定方法有物理和化学两类。
由于化学方法比较准确,常常使用之。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有醛基和酮基的糖类。
在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色强度成一定的比例关系,在550nm波长下测定棕红色物质的消光值,查对标准曲线并计算,便可分别求出样品中还原糖的含量。
该方法是半微量定糖法,操作简便,快速,杂质干扰较少。
操作方法
一、葡萄糖标准曲线的制定
取6支大试管,分别按下表顺序加入各种试剂:
表6葡萄糖标准曲线的制作
管号项目
空白
1
2
3
4
5
标准糖溶液(mL)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
蒸馏水(mL)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
DNS(mL)
3
3
3
3
3
3
煮沸10分钟,用水冷却
加蒸馏水(mL)
16
16
16
16
16
16
吹吸均匀
光密度(OD)
将上述各管溶液混匀后,在721分光光度计上用550纳米进行比色测定,用空白管溶液调零点。
记录光吸收值。
以葡萄糖浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制出标准曲线。
二、样品中还原糖含量的测定
1.样品中还原糖的提取:
准确称取新鲜苹果(去皮)1.0克,加少量蒸馏水于研钵中研磨,加蒸馏水洗研钵并移至大试管,放入50℃恒温水浴中保温30分钟。
保温完毕先用纱布过滤。
再用滤纸过滤,移入100mL容量瓶中。
将上清液作为还原糖待测液。
或直接取适量浓度的未知糖溶液进行测定。
2.样品中总糖的水解及提取
准确称取1克淀粉放入大试管中,加6mol/L的盐酸10mL,蒸馏水15mL,在沸水浴中加热0.5h后,取出1~2滴,用碘-碘化钾溶液检查水解是否完全,若已完全,则不出现蓝色。
水解毕冷却至室温后用6mol/L的NaOH调pH至中性,并定容至100mL,过滤,取滤液10mL于100mL容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。
3.样品中含糖量的测定
分别吸取两种待测液各1mL(作平行对照),按标准曲线制作方法精确加入各种试剂,将各管混匀后,测定各管的光密度,两管对照取平均值。
4.结果计算
在标准曲线上查出相应的还原糖含量,按下述公式计算出样品内还原糖的百分含量。
总糖(%)=
×100
还原糖(%)=
×100
试剂和器材
一、试剂
1.3,5-二硝基水杨酸试剂(又称DNS试剂):
182g酒石酸钾钠(A.R.)溶于500mL热水中,在热溶液中依次加入3,5一二硝基水杨酸(C.P.)6.3g,2mol/L的NaOH溶液262mL,,再加5g结晶苯酚(A.R.)和5g亚硫酸钠(C.P.),搅拌溶解。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
2.碘-碘化钾溶液:
把20克碘化钾和10克碘溶于100mL水中,使用前,取1mL加水稀释到10mL。
3.0.1%葡萄糖标准液:
准确称取100毫克分析纯的葡萄糖(预先在105℃烘至恒重),用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升,冰箱保存备用。
二、器材
(1)试管和试管架。
(2)吸量管(1毫升和2毫升)。
(3)容量瓶(100毫升)(4)恒温水浴锅
(5)721分光光度计
讨论
●DNS溶液配制的时候为什么要加入氢氧化钠、苯酚等试剂?
●DNS反应时为何要过量?
实验三蛋白质和氨基酸的呈色反应
一、目的要求
(1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
(2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。
二、原理
㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法
蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构,可以与某些试剂反应、生成有色物质。
1.双缩眠反应
当脲(即尿素)加热至l80℃时.两分子脲缩合,放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。
然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。
这一呈色反应称为双缩脲反应。
紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。
蛋白质或二肽以上的多肽分子中,含有多个与双缩脲结构相似的肽键,因此也有双缩脲反应。
应当指出,含有—个CS—NH2、一CH2一NH2,一CRH—NH2,一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2,-CHOH—CH2NH2等基团的物质,甚至过量的铵盐也干扰本实验。
2.Salkowski(1888)蛋白黄色反应
它是芳香族氨基酸,特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。
苯丙氨酸和苯
反应很困难。
皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄,原因在此。
硝基苯衍生物呈黄色,在碱性溶液中,它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
参考反应是:
3.茚三酮反应
蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。
除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色
外.其他氨基酸生成紫红色.最终为蓝色化合物。
三、器材与试剂
㈠器材
⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管
㈡试剂和材料
⒈10%NaOH溶液⒉1%CuSO4溶液⒊0.5%苯酚溶液⒋浓HNO3
⒌卵清蛋白溶液(蛋清:
水=1︰20)⒍尿素⒎0.1%茚三酮乙醇溶液
四、操作步骤
1.双缩脲反应
(1)取一支干燥的试管,加入少量尿素,用微火加热使尿素熔化,待融化的尿素重又开始硬化时停止加热,此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨(可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色)。
试管冷却后,加入约1毫升10%氢氧化钠溶液,振荡使双缩脲溶解,再加入2滴1%硫酸铜溶液,混匀后观察有无紫色出现。
(2)另取一支试管,加卵清蛋白溶液10滴,再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴,混匀,观察是否出现紫玫瑰色。
2.Salkowski(1888)蛋白黄色反应
(1)取一支试管,加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO33-4滴,加热,冷却后再加入10%NaOH溶液5滴,观察颜色变化。
(2)取一支试管,用0.5%苯酚溶液代替蛋白质溶液,重复上述操作,注意黄色的生成及最后变成橙色。
(3)剪一些指甲和头发分别放入2支试管中,各加入数滴浓硝酸,观察颜色的变化。
3.茚三酮反应
(1)取2支试管分别加入卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加入0.5ml0.1%茚三酮-乙醇溶液,混匀,在沸水浴中加热1-2分钟,冷却,观察颜色变化,并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。
(2)在一块滤纸片上滴加1滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,加1滴0.1%的茚三酮-乙醇溶液显色,用电吹风吹开显色。
观察出现的紫红色斑点。
五、实验记录
以“十”和“一”表明阳性、阴性反应,标明颜色并以“+”、“++”和“+++”表明颜色深浅程度。
六、思考题”
1综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。
2.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。
能对此作何结论?
3.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?
若不是。
为什么?
4.是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果,为什么?
是否大部分蛋白质呈现阳性结果。
为什么?
实验四蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法
一、目的要求
学习考马斯亮蓝(CoomssieBrilliantB1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质—染料结合的原理浓度的快速。
灵敏的方法。
考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式.红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsnderWaals’bond)结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’slaw)。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量.
蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h之后,蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质—染料复合物具有很高的消光系数.使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0.275光吸收值的变化,比lowry法灵短4倍,测定范围为10一1000ug蛋白质,微量测定法测定范围是1—10ug蛋白质。
此反应重复性好.精确度高,线性关系好.标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲,这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合,试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低.但直线弯曲程度很轻,不影响测定。
此方法干扰物少,研究表明:
NaCl,KCl,MgC12,乙醇,(N4H)2S04无干扰.强碱缓冲剂在测定中有一些颜色于扰,这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响.Tris,乙酸,2—巯基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污剂如TritonX—100,SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰,用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是,大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。
三、试剂与器材
㈠试剂
1.考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G—250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)磷酸。
2.标准蛋白质溶液
结晶牛血清清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
㈡测试样品
未知蛋白质溶液。
㈢器材
试管、试管架、移液管(5mL),微量取液器,721型分光光度计
四、操作方法
㈠标准法制定标准曲线
取14支试管.分两组按下表平行操作
表8考马斯亮蓝标准曲线制作方法
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
1mg/ml标准蛋白溶液/ml
0
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.15mol/LNaCl/ml
0.10
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
考马斯亮蓝试剂/ml
5
摇匀,1h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线:
以595nm为纵坐标.标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
㈡测定未知样品蛋白质浓度
测定方法同上,通过一定的稀释方法,取合适的未知样品体积。
使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
五、注意事项
(1)如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5—20min血内测定光吸收,因为在这段时间内颜色最稳定。
(2)测定中,蛋白—染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的,测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。
六、思考题
1.如果给定的蛋白质溶液浓度不在标准曲线的范围内,你应当采取什么的措施使其适用于考马斯亮蓝染色测定法?
2.测定蛋白质溶液浓度的方法还有哪些?
请列出三种以上。
实验五蛋白质的两性性质及等电点的测定
一、实验目的:
(1)通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
(2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理:
蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N-端α-氨基与C-端α-羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团,他们都能解离为带