组织化学技术5-免疫组化.ppt
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第三章第三章免疫组织化学免疫组织化学前言前言免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1发展简史发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
8080年代年代HsuHsu等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素（生素（ABCABC）法之后，免疫金法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
免疫电镜技术相继问世。
9090年代年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
胞化学分类方法迅速发展。
20002000年年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生个学科，是目前生命科学工作者应命科学工作者应该掌握的基该掌握的基本技术之一。
本技术之一。
2免疫组织化学的技术分类免疫组织化学的技术分类
（1）根据染色方式分成：
贴片染色漂浮染色
（2）根据AgAb结合方式分成：
直接法间接法多层法（3）按标记物的性质分成：
免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）3标记物标记物
（1）必要性：
组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物荧光素：
最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rhodamineRB200）荧光显微镜下发橙红色荧光酶：
辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
生物素：
（Biotin）铁蛋白金等：
主要应用于免疫电镜。
其他：
如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4应用应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。
用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。
一、免疫组织化学技术一、免疫组织化学技术
（一）染色方法
（一）染色方法1直接法直接法荧光素直接标记特异性抗体（抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。
酶标抗体要显示后镜检。
直接法优点：
简单，时间短，特异性强。
缺点：
灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。
应用：
基本不用了！
2间接法间接法荧光素标记在二抗上（二抗：
抗产生一抗动物的IgG抗体）。
显色后镜检特点：
较直接法灵敏，可标记一种抗体鉴定多种抗原。
3非标记非标记Ab桥法：
桥法：
“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。
（1）单桥法）单桥法
（2）双桥法双桥法在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。
特别提示：
注意动物种属关系4PAP法（过氧化物酶法（过氧化物酶抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法PeroxidasePeroxidaseantiantiperoxidaseperoxidasemethodmethod，PAPPAP法）法）是桥法的改良，既先形成PAP复合物抗原抗体抗IgG抗体PAP复合物。
该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。
标本可长期保存。
5ABC法（亲和素法（亲和素生物素生物素过氧化物酶复过氧化物酶复合物法，合物法，AvidinbiotinperoxidaseComplexmethod，ABC法）法）Avidin：
亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。
Biotin：
生物素维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。
（1）ABC复合物的制备：
ABC法与法与PAP法的区别是：
法的区别是：
以ABC复合物代替PAP复合物。
（2）ABC法反应原理法反应原理6SP或或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase）该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO。
它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。
现在还有plus盒。
优点是：
更简便，放大倍数，等电点中性更适合组织。
分子量小，穿透力，原理保密。
7蛋白蛋白A金法金法（ProteinAgoldmethod）多用于电镜8双重组化染色法双重组化染色法应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。
9免疫金免疫金银染色法银染色法（ImmunogoldsilverstainingIGSS）
（二）固定二）固定见前述见前述注意事项：
注意事项：
1固定剂的选择：
因组织而不同，注意质量和性能。
2固定方式的选择：
浸渍固定（参考文献）灌注固定（+后固定）蒸汽固定（三）免疫组化染色步骤（以（三）免疫组化染色步骤（以ABCABC法为例）法为例）1切片脱蜡入水，入PAS洗三次/15分钟。
2封闭内源性过氧化物酶。
用新配置的0.3H2O2（在PAS或0.05TrisHCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30分钟。
3水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！
），室温，30分钟。
5滴加第一抗体，4过液或室温51hour。
60.1MPBS，洗三次，每次5分钟。
7滴加第二抗体，室温1560。
80.1MPBS洗净，洗三次，每次5分钟。
9滴加ABC复合物，室温1560分钟。
100.1MPBS洗三次，每次5分钟。
110.05MTrisHCL510分钟，此步可省略。
12DABH2O2显色：
用0.01H2O2的DAB溶液，室温530分钟，随时镜检（DAB用时新配）13自来水洗净。
14用Mayer苏木精或0.5甲基绿，复染胞核（可不染）。
15常规脱水、透明、封固、镜检。
结果：
棕褐色反应产物代表抗原结果：
棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
的定位。
（四）免疫组化染色基本技术及注意事项（四）免疫组化染色基本技术及注意事项1实验计划实验计划根据课题的内容选用动物，选用配套的根据课题的内容选用动物，选用配套的AbAb。
如如AbAbII鼠抗人的抗体，与其他种属间无鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则交叉，则不能用其他动物，而且不能用其他动物，而且AbAb-必须是羊抗鼠，若必须是羊抗鼠，若PAPPAP法法AbAb-必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。
选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2Ab稀释度稀释度（如系购买的药盒有工作液和原液）（如系购买的药盒有工作液和原液）
（1）工作液：
无须稀释）工作液：
无须稀释
（2）原液：
）原液：
应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如：
工作液浓度为11000，可选150011000，11500试验；若:
1500有背景，11000阳性反应稍浅，可选1750进行试验。
原液的保存（20）冻存应选最佳稀度冻存。
若工作浓度大于1500则要先将原液稀释十倍，而后分装10l/瓶冻存（-20）于冰箱备用。
关于Ab保存应参照说明书。
（3）Ab浓度的选择Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。
并非Ab浓度越高越好。
3Ab滴片技术滴片技术所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
注意注意滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要领：
要领：
甩净组织周围的水。
4PBS洗涤技术洗涤技术
（1）洗涤的目的保证离子浓度和PH值。
减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）Ab滴片图示：
滴片图示：
（2）方法：
洗三次，每次5分钟。
5Ab孵育技术孵育技术
（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
（2）温度与时间4：
过液，1637：
1hor参考说明书6光镜控制显色方法光镜控制显色方法
（1）室内操作：
注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。
（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。
（五）对照组和染色结果的评价（五）对照组和染色结果的评价免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化染色实验组与对照组结果分析表从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。
15均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验or换用Ab。
除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价：
1阳性染色特点Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。
（非特异性细胞与组织无区别）染色强度不同：
颜色深浅不一（非特异性染色弥散性均匀）2组织切片制作过程的影响固定不良非特异性染色，显示不均。
边缘干燥非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。
3人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。
阳性对照：
阳性对照：
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。
对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。
阴性对照阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。
其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
染色失败的几种原因：
染色失败的几种原因：
（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。
全部（）原因可能：
染色未完全严格按照操作步骤进行；漏加一种抗体，或抗体失效；缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；底物中所加H2O2量少或失效；复染或脱水剂使用不当
（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：
切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。
缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。
使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
抗体温育的时间过长。
H2O2浓度过高，呈色速度过快。
粘附剂太厚。
（3）所有切片背景过深，原因可能是：
未加酶消化处理切片。
未加酶消化处理切片。
切片或涂片过厚。
切片或涂片过厚。
漂洗不够。
漂洗不够。
底物呈色反应过久。
底物呈色反应过久。
蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
使用全血清抗体稀释不够。
使用全血清抗体稀释不够。
（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因是：
标本的固定和处理不当。
二、免疫电镜技术二、免疫电镜技术前言：
前言：
免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。
是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。
其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术免疫细胞化学技术细胞水平（光镜分辨率）（光镜分辨率）电镜免疫细胞化学技术超微结构水平（电镜分辨率）
（一）组织固定与取材
（一）组织固定与取材要求：
即要求保持良好的超微结构，又要求保持组织的Ag性，固定的选择不宜过强。
常用：
14多聚甲醛+1戊二醛2过碘酸赖氨酸多聚甲醛液（PLPPLP）液
（二）免疫染色
（二）免疫染色1.包埋前染色：
包埋前染色：
即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。
优优点点：
抗原不易
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