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高级生化的文献翻译

由两个蛋白质组学技术用来识别比较蛋白质赤霉素在水稻中的调控

蛋白质组学已成为在植物生物学各领域的蛋白质的大规模分析的重要方法。

我们比较了两种蛋白质组学技术，二维液相色谱（2D-LC）和荧光二维差异凝胶电泳（2D-DIGE），他们找出水稻赤霉素（GA）调节蛋白的能力。

两周龄水稻幼苗分别用或不用5IM赤霉素48小时和蛋白质从叶鞘的基部区域中提取。

该蛋白由两种技术的分离之后，赤霉素应答的蛋白质的氨基酸序列使用蛋白质测序和质谱进行分析。

2D-LC和2D-DIGE能够解决1248蛋白组分和1500蛋白质，分别。

出于这些，2D-LC确定9蛋白质表达上调和9中被下调GA处理;2D-DIGE确定4上调和4下调蛋白质。

两种技术检测到重叠套蛋白质。

例如，胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶和光系统II放氧复合蛋白被鉴定为赤霉素调节蛋白的两种方法。

此外，这两种方法揭露未在2D-PAGE，随后通过考马斯亮蓝染色检测其以前没有报道赤霉素调节未知的蛋白质，和新的蛋白质。

这些结果表明，这两种方法是其中的一些非常有用的工具，用于检测蛋白质这可以起到在各种生理和发育过程中的植物。

关键词：

水稻·叶鞘·赤霉素·2D-LC·2D-DIGE

前言

在后基因组时代，蛋白质组学正变得越来越重要，因为蛋白质是直接相关的功能。

因为蛋白参与活细胞中大多数过程，蛋白质的详细了解是该研究的关键的细胞和生物分子水平。

此外，核苷酸序列提供有关的蛋白质补充的基因组编码只有有限的信息;转录后调控经常导致缺乏转录水平和蛋白丰度之间的相关性。

蛋白质组学必须解决的问题包括从简单的识别蛋白质对翻译后修饰，蛋白质-蛋白质相互作用，和亚细胞定位的鉴定。

因此，蛋白组学是日益复杂的细胞过程的调查越来越重要。

它也被成功地用于遗传和生理研究。

蛋白质组学已成为在植物生物学各领域的蛋白质的大规模分析的重要方法。

随着一些植物的基因组序列的可用性，植物蛋白质组学是打在基因组注释着越来越重要的作用，最近已经对植物生长发育，抗病性强，光合作用和植物功能等方面的理解应用。

在过去的十年里，水稻蛋白质组学领域长足的进步。

水稻是最重要的作物在世界之一，是主要的主食一半以上的世界人口。

水稻是由于其相对小的大约440兆的基因组也为单子叶作物物种的优良模式植物。

在日本晴品种的完整的基于地图的基因组序列已经完成，并且因此预计粳稻的完整基因组会解码，并提供给公众。

多种多样的完整基因组的分析的一部分，基因预测程序已被用于建立蛋白质的类别;再加上蛋白质功能研究，这些类别提供了更多的来自生物体的基因和基因组序列的有用的分类方案。

到目前为止，水稻蛋白质组学一些研究已经揭示不同的功能类别的蛋白质。

水稻蛋白质组数据库网站（http:

//gene64.dna.affrc.go.jp/RPD/main.html）已经建成并提供了对水稻蛋白质组研究进展的大量信息。

在水稻蛋白质组的以前的研究，两维（2D）的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）加上直接蛋白质测序和/或质谱（MS）用于蛋白质的分离和鉴定。

自从O'Farrell9表明，蛋白质可以基于解决在其等电点和分子量通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，2D-PAGE仍然受到质疑作为分析复杂的最有效的方式蛋白质混合物。

现代大幅面凝胶（例如，20〜20厘米）是高度可再现的和考马斯亮蓝（CBB）或银染色允许几百蛋白质可视化。

所检测到的斑点的颜色密度和大小使蛋白质定量。

这些方法的精确度，但是，是由多数的染色技术的低动态范围的限制。

荧光染料用于蛋白的最新发展克服了这一限制。

尽管2D-PAGE的力作为蛋白质组学工具，等电点的和分子量，可以通过这种技术来解决的范围是有限的。

因为它是难以分开使用等电聚焦碱性蛋白（pH值>8.0）根据奥法雷尔的方法（IEF）凝胶制备，固相pH梯度凝胶，其覆盖电点的范围从6.0到10.0，也已在使用的第一维。

蛋白质分离的这些限制，必须克服，以便识别在给定的蛋白质的所有蛋白质。

二维液相色谱（LC），它结合pH梯度和反相柱，是有望延长蛋白质分离的范围内的新的蛋白质组学技术。

同位素编码的亲和标签（ICAT）技术最近已开发出用于在无2D-PAGE的定量比较。

然而，关于再现性和所需的建立统计显着性尚未完全resolved.11替代“凝胶少”的方法，如多维蛋白质鉴定技术（MudPIT）重复数的问题，已有效地用于许多目录多肽在从几个生物体总蛋白的混合物，包括rice.14,15然而，虽然MudPIT是一个极好的手段，以产生本特定蛋白质样品中的蛋白质的详尽目录，它不会产生可再现的定量信息。

植物细胞分裂，生长和分化需要在开发过程中进行精确控制，以确保组织的协调发展。

植物激素是影响这些现象的最重要的因素之一。

植物细胞分裂，生长和分化需要在开发过程中进行精确控制，以确保组织的协调发展。

植物激素是影响这些现象的最重要的因素之一。

因此，植物激素赤霉素（GA）在很多重要的作用植物的生长发育，如种子发芽方面，茎伸长，叶片扩展，以及花和果实发育。

GA代谢和GA反应途径之间的密切互动最近revealed.TheGA及其反应途径的代谢还集成了与其他信号通路调节植物生长，因此，GA对发展的影响很可能是极其复杂的。

在这项研究中，2蛋白质组学技术，2D-LC和荧光2D差异凝胶电泳（2DDIGE），比较了其识别由植物激素的GA在水稻调节蛋白的能力。

实验步骤

植物材料和治疗。

水稻（OryzasativaL.cv.Nipponbare）幼苗生长于下白色荧光灯塑料育苗盆（600mol/平方米/秒，12小时光照期/天）在28℃和75％相对在一个生长室中的湿度（三洋，日本大阪）。

在2周后播种，育苗盆转移至塑料容器中含有5IM赤霉素（和光纯药，大阪，日本）48小时。

该实验重复10次;用于2D-LC实验5次，对于2D-DIGE另外5次。

六十苗，30苗的控制和治疗30苗，用于每个实验。

二维液相色谱分析。

叶鞘（500毫克）的基底区域匀浆用1mL的50mM的Tris-HCl（pH8.0）中，并与1.2毫升含有7.5M尿素，2.5M硫脲，12.5％甘油，50mM的三-裂解缓冲液盐酸（pH值8.0），2.5％正辛基葡糖苷，6.25毫三-（羧乙基）膦盐酸盐和1.25毫蛋白酶抑制剂（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），用玻璃研钵和杵在冰上。

每个匀浆离心15000克5分钟，并除去上清液。

将沉淀用一个附加的1.2毫升的裂解缓冲液并离心。

该合并上清液用经过2D-LC分析所述ProteomeLabPF2D试剂盒（BeckmanCoulter公司，富勒顿，CA）中根据制造商的建议。

用于第一维，将上清液（2毫克蛋白）注射到由AKTA探险家经营的色谱聚焦柱（AmershamBiosciences社制，皮斯卡塔韦，新泽西州），以及沿分离电点梯度。

用于第二维，所述的pI级分使用通过HPLC系统（吉尔森路易斯中心），操作反相柱分离。

HPLC数据分析，比较对照组和治疗，并显现为与ProteoVue软件（BeckmanCoulter公司）的梯形图案。

实验重复5次。

荧光染料标记。

叶鞘（500毫克）的基底区域匀浆用1mL含有8M尿素，2％的NonidetP-40（NP-40），0.8％两性电解质（pH为3.5-10和pH5-8，AmershamBiosciences社制裂解buffer9的），5％2-巯基乙醇和5％的聚（乙烯吡咯烷酮）-40，使用玻璃研钵和杵在冰上。

每个匀浆离心15000克5分钟并除去上清液。

将沉淀物洗涤用另外1.2毫升的裂解缓冲液并离心。

该合并的上清液混合，用50％三氯乙酸酸为10％的最终浓度。

将溶液保持冰和30分钟离心15000？

克10分钟。

该所得沉淀物用100IL冰冷乙醇，悬浮在标记缓冲液并用Cy5标记的Cy3或荧光染料（AmershamBiosciences社制）每个荧光染料标记的样品的等体积混合，加入到裂解缓冲液，通过2D-PAGE分离，如下所述，和扫描利用台风8600k可变成像仪（AmershamBiosciences社制）。

图像映射与DeCyder软件分析

（AmershamBiosciences社制）。

实验重复5次。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳。

为2D-PAGE9样品通过分离在第一维IEF。

IEF管胶11厘米长0.3厘米，直径分别为制备由8M尿素，3.5％的IEF凝胶溶液聚丙烯酰胺，2％的NonidetP-40，和2％两性电解质（pH为3.510和pH5-8）。

电泳中进行了在200伏为30分钟，随后400伏16小时和600伏1小时。

IEF后，

用15％进行SDS-PAGE中的第二维聚丙烯酰胺凝胶，用5％堆积凝胶。

分析个

酸序列，凝胶用CBB染色或深紫色（AmershamBiosciences社制）。

克利夫兰肽图谱。

继蛋白质分离通过2D-PAGE，含蛋白质斑点的凝胶片进行切并且蛋白用电泳进行电集中器（日本-伊杜，东京，日本）在2W恒定功率为2小时。

电洗脱后，将蛋白质溶液是透析去离子水2天并冷冻干燥。

蛋白质重新溶解在20IL的SDS样品缓冲液含有0.5M的Tris-HCl（pH为6.8），10％甘油，2.5％SDS中，和5％2-巯基乙醇，并装载到SDS-PAGE凝胶。

将样品覆盖有含有20IL的溶液

10伊尔金黄色葡萄球菌V8蛋白酶（0.1微克/IL;皮尔斯，罗克福德，IL）和10II的SDS样品缓冲液中。

电泳进行直到试样和蛋白酶进行层叠堆积胶，然后中断30分钟，以允许蛋白质消化。

N末端和内部氨基酸序列分析。

经过2D-PAGE和克利夫兰肽图谱，蛋白质和肽，分别通过电转移到聚（偏二氟乙烯）（PVDF）膜（Pall公司，港华盛顿州，纽约州）和CBB染色检测。

染蛋白质斑点或肽频带从PVDF膜上切并直接进行Edman降解在气相蛋白质测序仪（PROCISE方介绍，应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州）。

由蛋白质所确定的氨基酸序列音序与在蛋白质序列进行比较使用FASTA序列比对SWISSPROT数据库程序。

质谱分析。

蛋白质用CBB或深紫色后的2D-PAGE制备用于MS的3至5凝胶或描述previously.20这些蛋白质组分和通过2D-LC分馏蛋白质消化50mM10mM的Tris-HCl含有下午1点的胰蛋白酶（Sigma）中。

10小时。

所得的肽的纯化达到使用Zip-提示（Millipore公司，贝德福德，MA）。

纯化肽（2IL）直接加入到10毫克/毫升的R-氰基-4-羟基肉桂酸，0.3％三氟酸和50％乙腈矩阵，并空气干燥到一个板用于分析使用matrixassisted激光解吸电离时间飞行质谱（MALDITOFMS，航海家-DERP，AppliedBiosystems公司）。

匹配理论与实证消化肽质量的价值观和进行从数据库获得的序列信息使用吉祥物软件（矩阵科技有限公司，伦敦，UK）。

该实验进行2至4次。

对于MALDI-TOFMS分析。

标准被用于分配（Ⅰ）的偏差：

一个正匹配与已知的蛋白质实验和理论的肽质量之间需要的是小于50ppm;（II）的至少6个不同的预测肽群众需要相匹配的观察群众的鉴定被认为是有效的;（III）的匹配肽需要，以覆盖已知蛋白序列的至少30％;和（四）个人得分离子>51的身份或广泛同源性（P<0.05）。

Northernblot分析。

叶鞘样本基部被快速冷冻在液氮中，并研磨成粉末由

研钵和研杵。

总RNA根据分离Chomcyznki和Sacchi.21的过程Northern杂交

分析，20IG总RNA的分离对1.2％琼脂糖含有6％甲醛，并转移到一个Hybond-

N+尼龙膜（AmershamBiosciences公司）。

平等装载总RNA的Northern杂交金额被确定乙锭可视化溴染色rRNA的乐队。

PCR产品为探针，从琼脂糖凝胶中纯化（QIAEXII，凝胶提取试剂盒，Qiagen公司科学，日耳曼，MD），以及使用放射性标记的[R-32P]的dCTP（AmershamBiosciences社制）随机引物标记系统（RediprimeII，AmershamBiosciences社制）。

在超灵敏进行杂交杂交缓冲液（ULTRAhyb）在42℃下过夜。

将印迹在2×SSC，0.1％XSDS洗涤两次，在42℃下进行10分钟每然后两次0.1×SSC，0.1％SDS在68℃下进行15分钟，然后通过与该phosphorimage程序分析台风8600k可变成像仪。

结果与讨论

在叶的基部赤霉素的影响分析护套水稻幼苗。

GA起着许多重要的作用植物的生长和发育的多个方面，如种子发芽，叶鞘伸长，叶片扩展，花和水果的生长。

这是公认的气体是负责触发茎或节间的伸长率。

水稻幼苗，叶鞘基部部分包含根原基和分生组织细胞，进行积极的细胞分裂和development.22此功能的重要区域是网站的许多关键代谢和监管活动最终控制植物的高度和鲁棒性。

在以往的研究，水稻叶鞘蛋白用分析2D-PAGE与MS和/或直接蛋白质测序和783蛋白识别）。

在所得到的蛋白质，参与中心代谢的蛋白是最丰富的，没有明确的功能可以预测为20％proteins.在这项研究中，2D-LC和2D-PAGE用荧光染料标签被用来确定GA3-期间调节蛋白叶鞘的刺激延伸。

评估的有效推广水稻叶鞘伸长了GA3的条件下，2周苗切除叶鞘节段外源GA3不同时间段处理。

GA3的金额低至0.1IM外源性应用促进叶鞘伸长率和效果达到饱和5IM培养48小时后。

进一步检查对GA3行动叶鞘伸长，一时间过程动力学实验由处理叶鞘段进行用5íMGA3长达72小时。

叶鞘呈显著6小时，并在响应中伸长内48小时达到高峰GA3处理。

以前的报告显示，伸长率的叶鞘由5íMGA3内48小时强烈刺激，这个参数在随后experiments.23使用。

因此，在此研究中，将蛋白质从叶鞘提取为2周龄水稻幼苗基部处理具有或不具有5IM赤霉素48小时。

在赤霉素，调节蛋白的鉴定基底由2D-LC部分叶鞘。

蛋白从5IM萃取赤霉素处理和未经处理的组织进行纯化，用ProteomeLabPF2D套件，以及分离的pI梯度和反相列。

后的2D-LC，二维地图的图像进行分析，并使用ProteoVue软件（图1）可视化。

由此产生的二维地图显示，上调了9蛋白质和图9的蛋白质被下调赤霉素（图1）。

上调的蛋白质，指定LC1，LC3，LC4，LC11，LC14，LC15，LC16，LC17，LC18和，被确定为未知的蛋白质，光系统II放氧蛋白，热休克蛋白β-1（HSP27），超氧化物歧化酶[Cu-Zn类]，ATP酶的α亚基，胞质glyceralaldehyde-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），酰基-CoA结合蛋白质，和图2的核糖体蛋白（表1）。

在下调的蛋白质，指定LC2，LC5，LC6，LC7，LC8，LC9，LC10，LC12，和LC13，包括光系统II放氧蛋白，2-GAPDHs，磷酸结合周质ABC转运，并4蛋白不能被确定（表1）。

光系统二放氧蛋白和GAPDHs被检测为两个上调和下调的蛋白质。

我们假设它们代表一个多基因家族的不同成员，或者也许不同形式的同种蛋白质。

在赤霉素，调节蛋白的鉴定通过基础2D-DIGE部分叶鞘。

蛋白从5íMGA3处理和未处理的组织中提取被用Cy5标记方法：

6主要的在低对比度分析（图2A）

和2个次级在高对比度分析（图2B）。

该4蛋白是上调GA3处理，显示为FD1，FD2，FD3，FD4和二维地图中，过氧化氢酶是，GAPDH，钙网蛋白，和光系统II放氧蛋白（表2）。

另一方面，4蛋白，显示为FD5，FD6，FD7，和FD8，分别下降了赤霉素处理;这些都是ATP硫酸化酶（ATPS3），抗性基因类似物，和2未知

蛋白（表2）。

在基础的赤霉素，调节蛋白的功能部分叶鞘。

其中蛋白质增加GA3是光系统II放氧蛋白（LC3和FD4）。

此蛋白质是由这两种检测的2D-LC系统和2D-DIGE，以及在我们以前的studies.20,23将上调在叶鞘显示光系统II放氧的蛋白质在这个器官光合活性增加了GA3治疗。

过氧化氢酶也被检测为在2D-PAGE分析一个赤霉素-上调的蛋白质。

这种酶是参与活性氧自由基反应和解毒过氧化氢H2O2.25由超氧化物歧化酶，其将产生超氧化物（O2-），过氧化氢的防御活性氧species.We提出了两种可能的解释的上调过氧化氢酶的GA3处理叶鞘。

首先，生长响应的值与细胞壁松反应和降解

细胞壁polysaccharides.26羟基自由基（¥OH），过氧化氢与氧反应生成-，已报告的多糖，如裂解过程中，以增加透明质酸，壳聚糖和pullulan.26因此，增加过氧化氢酶，可能需要以清除过氧化氢由电池产生的在基底区域延伸墙松动。

其次，反应photosynthesis.25期间也会产生氧因此，在赤霉素处理的叶的增加光合作用鞘（见上文）也可能增加，需要过氧化氢酶。

GAPDH（LC15和FD4）被确定为一个赤霉素-上调蛋白质由双方2D-LC和2D-DIGE，虽然2GAPDHs（LC5

和LC6）均下调。

在我们以往的研究中，GAPDH被发现increased20和响应在叶鞘伸长GA3。

另一方面，2个GAPDHs下调GA3还需要进一步physi-ological实验。

GAPDH通过可逆地催化的D-甘油醛-3-磷酸氧化和磷酸化起着糖酵解和糖异生中起重要作用以D-1,3biphosphoglycerate。

所述酶是NAD+的具体并且发现在这两个光合的细胞质和非光合组织。

GADPH也是一个重要组成部分糖原代谢。

GADPH的磷酸化赤霉素处理水稻叶鞘后发现可能意味着这种酶是参与GA信号转导。

然而，GADPH的丰度也增加了GA3处理在稻叶sheath27和水稻悬浮培养cells.20因此，GADPH的增加的标签可能反映GAstimulated蛋白质而非遗传效应的积累对磷酸化。

nonphosphorylating小麦，活动GADPH据报道，通过磷酸化来调节，二价阳离子，和14-3-3proteins.28因此，磷酸化GADPH后GA3处理表明，GA3激活稻叶鞘细胞的代谢以允许增加

超氧化物歧化酶[Cu-Zn类]（LC11）是上调这项研究，并在先前的study.20超氧化物歧化酶[铜锌]是所述病原体的防御的重要组成部分在大多数机构。

钙网蛋白（FD3）也上调在本研究和以前的研究。

钙网蛋白是钙离子结合性的内质网的蛋白质和也可以用作分子。

在病原体诱导诱发剂在烟草信令，钙网蛋白。

钙依赖性蛋白激酶CDPK13可能是在一个重要的信号分量响应GA和冷的。

冷应激的连接反应可能是间接的，并OsCDPK13可以简单地是参与GA信号。

如果是这样的话，那么钙网和超氧化物歧化酶[Cu-Zn类]也可参与GA信号，只有间接连接到其他应激响应。

如图3，光系统II的丰度放氧蛋白和GADPH增加了赤霉素然而，这些基因的表达水平没有改变由赤霉素（图3）。

此外，光系统II放氧蛋白和GADPH表明不断增加播种后（图4）。

这些结果表明，从根本上通过检测到的叶鞘伸长重要的蛋白质多种方法。

在此检测到的至少两种蛋白质研究中，光系统II放氧蛋白和GAPDH，是与叶鞘伸长率密切相关。

这个结果意味着光合作用和糖酵解是，至少间接地，GA-响应。

图3

两个蛋白质组学技术的识别比较蛋白质由赤霉素水稻调控。

通过2D-LC和

2D-DIGE1248蛋白质组分和1500蛋白质分别为解决，分别。

这些蛋白质，2D-LC标识9蛋白表达上调和9蛋白质是下调GA3处理，而2D-DIGE标识4上调和4下调的蛋白质。

在我们以前的研究，32proteins24和8proteins20被发现是

由GA在叶鞘伸长率监管。

Shen等。

研究叶鞘部分治疗GA3在培养皿中。

田中从具有完整的处理秧苗等al.20使用叶鞘GA3。

虽然使用叶鞘检测32蛋白段，它们主要是与压力相关的蛋白质。

的情况下完整的治疗，20只5的蛋白质均在正常范围的IEF的;其他3迁移到固相pH梯度凝胶的碱性侧。

这些结果表明，2DLC与2D-DIGE是强大的方法，以前检测错过了改变蛋白质。

使用这两种技术，越来越多的蛋白质为检测与2D-PAGE后CBB染色进行比较。

使用前面的方法，GADPH和光系统IIoxygenevolving复杂的蛋白质被检测为GA3调节蛋白质。

然而，这两个新的方法在这里测试的检测GA3调控未知的，新颖的蛋白质不先前报道，并且不通过2D-PAGE，随后检测通过CBB染色。

仅通过2DDIGE检测次要的GA应答的蛋白质。

一种在基底区域中的减少的蛋白质下面GA3处理是ATP硫酸（FD5）。

ATP硫酸化酶，硫酸盐同化途径的第一个酶，是主要定位于质体，但也有一个小的胞质form.33植物硫代谢的某些方面，

它包括硫的运输和循环/降解化合物，仍然unclear.33尽管如此，在下降后GA3应用ATP硫酸表明，GA调控硫代谢的水稻植物的第一步。

仅通过检测低分子量蛋白质2D-LC系统。

其中之一是酰基辅酶A结合蛋白

（LC16）。

胞质10-kDa的酰基辅酶A结合蛋白是普遍存在在真核生物和跨物种是高度保守的，这表明他们physiologicalroles被保存通过进化。

在植物中，脂肪酸在合成的叶绿体导出为酰基辅酶A酯的质reticulum.34中的增加的酰基辅酶A结合蛋白以下GA3处理表明，GA调节脂质代谢。

这些结果表明，2D-LC和2D-DIGE是其中一些的，用于检测的低调节蛋白的非常有用的工具分子量或低丰度。

结束语

2D-LC技术被开发，以改善蛋白质的混合物在不存在定量比较2D-PAGE的并且是用于检测低的优选方法分子量蛋白质。

但是，重复性差，需要大量重复的建立统计意义是仍必须解决的问题。

在另一方面，2D-DIGE技术可以使精确定量比较，是非常敏感的。

因此，研究GA的作用机理，既有2D-LC和2D-DIGE方法，连同其他蛋白质的方法，是非常重要的。

这样研究将为我们提供有关增加知识农业上重要性状调控和加快作物育种与生产效率高，质量好，而且广阔的抗逆性。

缩写：

2D，二维;PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳;LC，液相色谱法;2D-DIGE，

荧光二维差异凝胶电泳;MS，质谱;IEF，等电聚焦;PVDF，聚（偏二氟乙烯）;GA，赤霉素。

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