维生素B2片分析方法验证方案.docx

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维生素B2片分析方法验证方案

一．概述

1.维生素B2片含量测定：

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）为流动相；检测波长为444nm。

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

1.2测定法避光操作。

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素B210mg），置500ml量瓶中，加盐酸溶液（1→2）10ml，振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。

按外标法以峰面积计算，即得。

1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0%～110.0%。

2.维生素B2片溶出度测定：

照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）

测定法避光操作。

取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401），在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数（

）为323计算每片的溶出量。

限度为标示量的75%，应符合规定。

3.维生素B2片有关物质测定：

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件照含量测定。

避光操作。

取本品的细粉适量（约相当于维生素B210mg），置100ml量瓶中，加盐酸溶液（1→2）5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍（1.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0%）。

供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.025倍的色谱峰忽略不计。

4.工艺处方组成

规格：

5mg

物料名称

基准处方1000片

维生素B2

5.00g

淀粉

30.70g

糊精

24.00g

硬脂酸镁

0.30g

45%乙醇溶液

21.00g

乙醇（95%）

9.75g

纯化水

11.25g

合计

60g

5、仪器基本情况：

设备名称

XXXX

设备编号

XXXX

型号

XXXX

出厂编号

XXXX

出厂日期

XXXX

安装位置

XXXX

生产厂家

日本岛津

供货厂家

岛津国际贸易（上海有限公司）

设备名称

XXX

设备编号

XXXX

型号

XXXX

出厂编号

XXXX

生产厂家

XXX

安装位置

XXXX

供货厂家

岛津公司

6.相关术语：

6.1准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

一般用回收率（%）表示。

回收率限度应在98%～102%之间。

6.2精密度系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

6.3线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈比例关系的程度

6.4范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。

6.5检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。

6.6耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

二.验证目的

通过验证以确认所采用的方法适合于维生素B2片的测定。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行维生素B2片检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

三.验证依据

中国药典2015年版二部

中国药典2015年版四部9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》

四.参考文件

1、验证管理规程

2、验证总计划

3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程

4UV-1800紫外可见分光光度计操作维护保养规程

5、中国药典2015年版

6、变更控制规程

7、偏差控制规程

XXXX

五.验证步骤

1.维生素B2片含量分析方法验证

1.1系统适应性试验

1.1.1色谱条件

①固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

②检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

③流动相：

0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）

④流速：

1.0mL/min。

⑤柱温：

30℃

⑥进样量：

20μL。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.1.2系统适用性试验溶液：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，

1.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。

1.1.4判定标准：

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

1.2维生素B2片含量分析方法线性验证

1.2.1溶液配制

1.2.1流动相配制

0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）为流动相

1.2.2处方量辅料配制

精密称定淀粉约307mg、糊精约240mg、硬脂酸镁约3mg、混合。

此混合辅料约为10片维生素B2（50mg）所需的辅料共约550mg。

1.2.3样品溶液配制

精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg/ml的溶液。

按80%、90%、100%、110%、120%的倍数稀释，精密量取8ml、9ml、10ml、11ml、12ml分别置50ml容量瓶中，加水配置成浓度为16µg/ml、18µg/ml、20µg/ml、22µg/ml、24µg/ml的溶液。

1.2.2测定

精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。

按外标法以峰面积计算。

1.2.3判定标准：

维生素B2在16µg/ml至24µg/ml的浓度范围内，维生素B2峰面积成线性且相关系数R≥99.8%。

1.3维生素B2片含量分析方法精密度验证

1.3.1流动相配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。

1.3.2样品溶液配制

取维生素B2片20片（XXXX生产），精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B210mg）置500ml量瓶中，盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg/ml的溶液,取续滤液作为样品溶液。

1.3.3测定

精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6次，得到维生素B2峰面积，计算维生素B2峰的Srel。

1.3.4判定标准：

维生素B2峰面积的Srel≤2.0%。

1.4维生素B2片含量分析方法准确度验证

1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。

1.4.2样品溶液配制

精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg/ml的溶液。

按80%、100%、120%的倍数稀释,精密量取续滤液8ml、10ml、12ml，分别置于50ml容量瓶中，加水配制成浓度为16µg/ml、20µg/ml、24µg/ml的测试溶液。

1.4.3测定

精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B2峰面积。

通过线性方程计算维生素B2浓度。

用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。

1.4.4判定标准：

回收率限度应在98%-102%之间，回收率的Srel≤2.0%。

1.5维生素B2片含量分析方法范围验证

1.5.1数据记录及结果计算

依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法符合《中国药典》2015版维生素B2峰含量的范围一般为测定浓度的范围。

1.5.2判定标准：

含量的范围一般为测定浓度的80%〜120%。

1.6维生素B2片含量分析方法专属性验证

1.6.1流动相配制、溶剂Ⅰ配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。

1.6.2溶液配制

1.6.2.1供试品溶液：

取维生素B2片（XXXX生产）20片，精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品（约相当于维生素B210mg），置500ml量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg/ml的溶液,取续滤液作为供试品溶液。

1.6.2.2对照品溶液：

精密称取维生素B2对照品10mg，置500ml量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,制成20µg/ml的对照品溶液。

1.6.2.3空白溶液：

在500ml量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇，再加水稀释至刻度，摇匀,作为空白溶液。

1.6.2.4阴性溶液：

按照片剂配方，加入处方量混合辅料55mg，置250ml量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml），加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,续滤液，作为阴性溶液。

1.6.3测定

精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶液、阴性溶液各20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。

1.6.4判定标准：

维生素B2对照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致，空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。

1.7维生素B2片含量分析方法耐用性验证

1.7.1改变流动相比例

1.7.1.1色谱条件

①固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

②检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

③流动相：

0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（80∶15∶5）为流动相

④流速：

1.0mL/min。

⑤柱温：

30℃

⑥进样量：

20μL。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.7.1.2系统适用性试验溶液：

系统适用性试验溶液：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，

1.7.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。

1.7.2改变柱温及流动相

1.7.2.1色谱条件

①固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

②检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

③流动相：

0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）为流动相

④流速：

1.0mL/min。

⑤柱温：

33℃

⑥进样量：

20μL。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.7.1.2系统适用性试验溶液：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含维生素B220µg的溶液。

1.7.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。

1.7.2.2系统适用性试验溶液：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含维生素B220µg的溶液。

1.7.2.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。

1.7.3判定标准：

在改变流动相比例及改变柱温后，方法通过系统适用性试验,理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

2.维生素B2片溶出度分析方法验证

2.1维生素B2片溶出度分析方法线性验证

照溶出度与释放度测定法（通则0931第一法（篮法）及紫外分光光度法测定法测定（通则0401）。

2.1.1溶液配制

2.1.1.1溶出介质制备：

冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。

2.1.1.2样品溶液配制

分别精密称定维生素B2对照品约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg，置100ml容量瓶中，加溶出介质溶解并稀释至刻度,摇匀，分别制成含维生素B2浓度约为6µg/ml、7µg/ml、8µg/ml、9µg/ml、10µg/ml的溶液。

2.1.2测定

以溶出介质作为空白试验；照紫外分光光度法，取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A，记录色谱图。

（图谱附后）

2.1.3判定标准：

维生素B2片在6µg/ml至10µg/ml的浓度范围内，维生素B2溶出度吸光度成线性且相关系数R≥99.0%。

2.2维生素B2片溶出度分析方法精密度验证

2.2.1样品溶液配制

取维生素B2片1片（XXXX生产），以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。

照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。

经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml，滤过,作为样品溶液。

2.2.2测定

取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A。

2.2.3判定标准：

维生素B2片溶出度溶液峰面积的Srel≤2.0%。

2.3维生素B2片溶出度分析方法耐用性验证

2.3.1样品溶液配制

取维生素B2片1片（XXXX生产），以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。

照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。

经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml，滤过,作为样品溶液。

2.3.2测定

样品溶液，在室温下放置，分别于0、1、2、3、4、5、6小时精密样品溶液，在444nm的波长处测定吸光度A。

2.3.3判定标准：

溶出度溶液6小时内溶液稳定，维生素B2片溶出度溶液峰面积的RSD≤2%。

2.4维生素B2片溶出度分析方法准确度验证

2.4.1处方量原辅料配制

处方量50%原辅料：

精密称定维生素B2对照品2.5mg、淀粉约15.35mg、糊精约12mg、硬脂酸镁约0.15mg。

混合。

处方量80%原辅料：

精密称定维生素B2对照品4mg、淀粉约24.56mg、糊精约19.2mg、硬脂酸镁约0.24mg。

混合。

处方量100%原辅料：

精密称定维生素B2对照品5mg、淀粉约30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约0.3mg。

混合。

2.4.2样品溶液配制

分别将处方量50%、80%、100%原辅料置溶出杯中，加冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。

经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml，滤过,作为样品溶液。

每个浓度水平配制3份。

2.4.3测定

取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A，记录色谱图，得到维生素B2的吸光度。

通过线性方程计算维生素B2浓度。

用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。

2.4.4判定标准：

回收率应为标示量的95%-105%之间，回收率的Srel≤2.5%。

3.维生素B2片有关物质分析方法验证

3.1系统适用性实验

3.1.1色谱条件

1　固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

2　检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

3　流动相：

0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：

乙腈：

甲醇=85：

10：

5。

4　流速：

1.0mL/min。

5　柱温：

30℃

6　进样量：

20μL。

3.1.2测定方法

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

3.1.3溶液配制

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液。

3.1.4取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。

3.1.5系统适应性试验

取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.1.6判定标准：

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

3.2维生素B2片有关物质分析方法专属性验证

3.2.1溶液配制

A.处方量辅料：

精密称定淀粉约30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约0.3mg。

混合。

B.供试品溶液：

取维生素B2片（XXXXX生产）20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于维生素B210mg），置100ml的量瓶中，加盐酸溶液（1→2）5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，充分振摇匀，使维生素B2溶解并加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液，作为供试品溶液。

C.空白溶液：

取已配制的全部处方量辅料，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（1→2）5ml，充分振摇匀，加水并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液，作为储备液。

3.2.2测定

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件同3.1.1。

精密量取供试品溶液和储备液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.2.3判定标准：

维生素B2片在444nm处有吸收峰出现，维生素B2片的处方量辅料无吸收峰出现，维生素B2片的处方量辅料不干扰有关物质的检查。

3.3维生素B2片有关物质分析方法检测限验证

3.3.1溶液配制

供试品溶液：

见专属性验证项下供试品溶液。

样品溶液：

取供试品溶液适量，加水分别配置成100µg/ml、50µg/ml、25µg/ml、12.5µg/ml、2.5µg/ml、0.25µg/ml、0.025µg/ml浓度的溶液。

3.3.2测定

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件同3.1.1。

精密量取样品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.3.3判定标准：

当S/N≈3时为检测限。

3.4维生素B2片有关物质分析方法耐用性验证

3.4.1溶液配制：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，作为系统适用性实验溶液。

3.4.2

色谱条件

1　固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

2　检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

3　流动相：

0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：

乙腈：

甲醇=85：

10：

5。

4　流速：

1.0mL/min。

5　柱温：

33℃

6　进样量：

20μL。

3.4.3测定

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.4.4判定标准：

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

3.5维生素B2片有关物质分析方法耐用性验证

3.5.1溶液配制：

取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1→2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。

溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，作为系统适用性实验溶液。

3.5.2

色谱条件

1　固定相：

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；

2　检测器：

紫外检测器，检测波长444nm；

3　流动相：

0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：

乙腈：

甲醇=80：

15：

5。

4　流速：

1.0mL/min。

5　柱温：

35℃

6　进样量：

20μL。

3.5.3测定

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.5.4判定标准：

理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。

七、变更/偏差控制：

1、如验证过程中出现变更，则按《变更控制程序》进行。

2、如验证过程中出现偏差，则按《偏差控制程序》进行。

3、任何可接受的变更/调查/偏差和采取的措施，均应记载在下表中。

4、变更/调查/偏差纪录

序号

变更/偏差编号

问题简述

是否附报告

处理日期

填写人/日期：

复核人/日期：

QA检查人/日期：

所附的变更/调查/偏差修正报告和支持文件，应作为此文件的附录部分。

八.附件：

序号

附件名称

填写人/日期：

复核人/日期：

QA检查人/日期：

九.变更记载及原因

修订号

执行日期

变更原因、依据及详细变更内容

01

XXXX

首次验证。