维生素B2片分析方法验证方案.docx

1、维生素B2片分析方法验证方案一 概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。1.1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85105)为流动相；检测波长为444nm。理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。1.2测定法 避光操作。 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(12)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱

2、图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% 110.0%。2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法 避光操作。取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。限度为标示量的75%，应符合规定。3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色

3、谱法（通则0512）测定。色谱条件 照含量测定。避光操作。取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（12)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。供试品溶

4、液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.025倍的色谱峰忽略不计。4.工艺处方组成规格：5mg物料名称基准处方1000片维生素B25.00g淀粉30.70g糊精24.00g硬脂酸镁0.30g45%乙醇溶液21.00g乙醇（95%）9.75g纯化水11.25g合计60g 5、仪器基本情况：设备名称XXXX设备编号XXXX型 号XXXX出厂编号XXXX出厂日期XXXX安装位置XXXX生产厂家日本岛津供货厂家岛津国际贸易（上海有限公司） 设备名称XXX设备编号XXXX型 号XXXX出厂编号XXXX生产厂家XXX安装位置XXXX供货厂家岛津公司 6.相关术语：6.1准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参

5、考值接近的程度。一般用回收率（%）表示。回收率限度应在98%102%之间。6.2精密度系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。6.3线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈比例关系的程度6.4范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。6.5检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。6.6耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。二.验证目的 通过验证以确认所采用的方法适合于维生素B2片的测定。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行

6、试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行维生素B2片检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。三.验证依据中国药典2015年版二部中国药典2015年版四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则四.参考文件1、验证管理规程 2、验证总计划 3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程 4 UV-1800紫外可见分光光度计操作维护保养规程 5、中国药典2015年版6、变更控制规程 7、偏差控制规程 XXXX五.验证步骤 1. 维生素B2片含量分析方法验证1.1系统适应性试验1.1.1色谱条件固定相：十八烷基硅烷键

7、合硅胶色谱柱（C18）；检测器：紫外检测器，检测波长444nm；流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85105)流 速：1.0mL/min。柱 温：30进样量：20L。照高效液相色谱法（通则0512）测定。 1.1.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20g的溶液，1.1.3取系统适用性试验溶液20L注入液相色谱仪。1.1.4判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。 1.2维

8、生素B2片含量分析方法线性验证1.2.1溶液配制1.2.1流动相配制0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85105)为流动相1.2.2处方量辅料配制精密称定淀粉约307mg、糊精约240mg、硬脂酸镁约3mg、混合。此混合辅料约为10片维生素B2（50mg）所需的辅料共约550 mg。1.2.3样品溶液配制精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100g /ml的溶液。按80%、90%、1

9、00%、110%、120%的倍数稀释，精密量取8ml、9ml、10ml、11ml、12ml分别置50ml容量瓶中，加水配置成浓度为16g /ml、18g /ml、20g/ml、22g /ml、24g /ml的溶液。1.2.2测定精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液20l，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。按外标法以峰面积计算。1.2.3判定标准：维生素B2在16g /ml至24g /ml的浓度范围内，维生素B2峰面积成线性且相关系数R99.8%。 1.3维生素B2片含量分析方法精密度验证1.3.1流动相配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。1.3.2样品溶液配制取维生素B

10、2片20片（XXXX生产），精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B2 10mg）置500ml量瓶中，盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20g /ml的溶液,取续滤液作为样品溶液。1.3.3 测定精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6次，得到维生素B2峰面积，计算维生素B2峰的Srel。1.3.4判定标准：维生素B2峰面积的Srel2.0%。 1.4维生素B2片含量分析方法准确度验证1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。1.4.2样品溶液配制精密

11、称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100g /ml的溶液。按80%、100% 、120%的倍数稀释,精密量取续滤液8ml、10ml、12ml，分别置于50ml容量瓶中，加水配制成浓度为16g /ml、20g /ml、24g /ml的测试溶液。1.4.3测定精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B2峰面积。通过线性方程计算维生素B2浓度。用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。1.4.4判定标准：回收率限度

12、应在98%-102%之间，回收率的Srel2.0%。 1.5维生素B2片含量分析方法范围验证1.5.1数据 记录及结果计算依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法符合中国药典2015版维生素B2峰含量的范围一般为测定浓度的范围。1.5.2判定标准：含量的范围一般为测定浓度的 80%120%。 1.6维生素B2片含量分析方法专属性验证1.6.1流动相配制、溶剂配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。1.6.2溶液配制1.6.2.1供试品溶液：取维生素B2片（XXXX生产）20片，精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品（约相当于维生素B2 10mg），

13、置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20g /ml的溶液,取续滤液作为供试品溶液。1.6.2.2对照品溶液：精密称取维生素B2对照品10mg，置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,制成20g /ml的对照品溶液。1.6.2.3空白溶液：在500ml量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇，再加水稀释至刻度，摇匀,作为空白溶液。1.6.2.4阴性溶液：按照片剂配方，加入处方量混合辅料55mg，置250ml

14、量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml），加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,续滤液，作为阴性溶液。1.6.3测定精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶液、阴性溶液各20l，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。1.6.4判定标准：维生素B2对照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致，空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。 1.7维生素B2片含量分析方法耐用性验证1.7.1改变流动相比例1.7.1.1色谱条件固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；检测器：紫外检测器，检测波长444nm；流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的

15、0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(80155)为流动相流 速：1.0mL/min。柱 温：30进样量：20L。照高效液相色谱法（通则0512）测定。1.7.1.2系统适用性试验溶液：系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20g的溶液，1.7.1.3取系统适用性试验溶液20L注入液相色谱仪。1.7.2改变柱温及流动相1.7.2.1色谱条件固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；检测器：紫外检测器，检测波长444nm；流动相：

16、0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85105)为流动相流 速：1.0mL/min。柱 温：33进样量：20L。照高效液相色谱法（通则0512）测定。1.7.1.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含维生素B2 20g的溶液。1.7.1.3取系统适用性试验溶液20L注入液相色谱仪。1.7.2.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振

17、摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含维生素B2 20g的溶液。1.7.2.3取系统适用性试验溶液20L注入液相色谱仪。1.7.3判定标准：在改变流动相比例及改变柱温后，方法通过系统适用性试验,理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。2. 维生素B2片溶出度分析方法验证2.1维生素B2片溶出度分析方法线性验证照溶出度与释放度测定法（通则0931第一法（篮法）及紫外分光光度法测定法测定（通则0401）。2.1.1溶液配制2.1.1.1溶出介质制备：冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。2.1.1.

18、2样品溶液配制分别精密称定维生素B2对照品约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg，置100ml容量瓶中，加溶出介质溶解并稀释至刻度,摇匀，分别制成含维生素B2浓度约为6g/ml、 7g/ml、8g/ml、9g/ml、10g/ml的溶液。2.1.2测定以溶出介质作为空白试验；照紫外分光光度法，取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A，记录色谱图。（图谱附后）2.1.3判定标准：维生素B2片在6g/ml至10g/ml的浓度范围内，维生素B2溶出度吸光度成线性且相关系数R99.0%。 2.2维生素B2片溶出度分析方法精密度验证2.2.1样品溶液配制取维生素B2片1片（XXXX生产），

19、以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10 ml，滤过,作为样品溶液。2.2.2 测定取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A。 2.2.3判定标准：维生素B2片溶出度溶液峰面积的Srel2.0%。 2.3维生素B2片溶出度分析方法耐用性验证2.3.1样品溶液配制取维生素B2片1片（XXXX生产），以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，

20、依法操作。经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10 ml，滤过,作为样品溶液。2.3.2 测定样品溶液，在室温下放置，分别于0、1、2、3、4、5、6小时精密样品溶液，在444nm的波长处测定吸光度A。2.3.3判定标准：溶出度溶液6小时内溶液稳定，维生素B2片溶出度溶液峰面积的RSD2%。2.4维生素B2片溶出度分析方法准确度验证2.4.1 处方量原辅料配制处方量50%原辅料：精密称定维生素B2对照品2.5mg、淀粉约15.35mg、糊精约12mg、硬脂酸镁约0.15mg。混合。处方量80%原辅料：精密称定维生素B2对照品4mg、淀粉约24.56mg、糊精约19.

21、2mg、硬脂酸镁约0.24mg。混合。处方量100%原辅料：精密称定维生素B2对照品5mg、淀粉约30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约0.3mg。混合。2.4.2样品溶液配制分别将处方量50%、80%、100%原辅料置溶出杯中，加冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，照溶出度第一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。经20分钟时，在浆叶顶端至液面中心,距溶出杯内壁10mm处取溶液10 ml，滤过,作为样品溶液。每个浓度水平配制3份。2.4.3 测定取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A，记录色谱图，得到维生素B2的吸光度。通过线性方程

22、计算维生素B2浓度。用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。2.4.4判定标准：回收率应为标示量的95%-105%之间，回收率的Srel2.5%。 3. 维生素B2片有关物质分析方法验证3.1系统适用性实验3.1.1 色谱条件1固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；2检测器：紫外检测器，检测波长444nm；3流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙腈：甲醇=85：10：5。4流 速：1.0mL/min。5柱 温：306进样量：20L。3.1.2测定方法按高效液相色谱法（通则0512）测定。3.1.3 溶液配制取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液

23、（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20g的溶液。3.1.4取系统适用性试验溶液20L注入液相色谱仪。3.1.5系统适应性试验取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。3.1.6判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。 3.2维生素B2片有关物质分析方法专属性验证3.2.1溶液配制A.处方量辅料：精密称定淀粉约30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约0.3mg。混合。B.供试品溶液：取维生素B2片（XXXXX生产）20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于维生素B2 10

24、mg），置100ml的量瓶中，加盐酸溶液（12）5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，充分振摇匀，使维生素B2溶解并加水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液，作为供试品溶液。C.空白溶液：取已配制的全部处方量辅料，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（12）5ml，充分振摇匀，加水并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液，作为储备液。3.2.2 测定按高效液相色谱法（通则0512）测定。色谱条件同3.1.1。精密量取供试品溶液和储备液各20l，注入液相色谱仪，记录色谱图。3.2.3判定标准：维生素B2片在444nm处有吸收峰出现，维生素B2片的处方量辅料无吸收峰出现，维生素B2片的处方量辅料不干扰有关物

25、质的检查。 3.3维生素B2片有关物质分析方法检测限验证3.3.1溶液配制供试品溶液：见专属性验证项下供试品溶液。 样品溶液：取供试品溶液适量，加水分别配置成100g/ml、50g/ml、25g/ml、12.5g/ml、2.5g/ml、0.25g/ml、0.025g/ml浓度的溶液。3.3.2 测定按高效液相色谱法（通则0512）测定。色谱条件同3.1.1。精密量取样品溶液20l，注入液相色谱仪，记录色谱图。3.3.3判定标准：当S/N3时为检测限。 3.4维生素B2片有关物质分析方法耐用性验证3.4.1溶液配制：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml

26、）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20g的溶液，作为系统适用性实验溶液。3.4.2 色谱条件1固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；2检测器：紫外检测器，检测波长444nm；3流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙腈：甲醇=85：10：5。4流 速：1.0mL/min。5柱 温：336进样量：20L。 3.4.3测定按高效液相色谱法（通则0512）测定。取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。3.4.4判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。 3.5维生素B2片有

27、关物质分析方法耐用性验证3.5.1溶液配制：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(12)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20g的溶液，作为系统适用性实验溶液。3.5.2 色谱条件1固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；2检测器：紫外检测器，检测波长444nm；3流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙腈：甲醇=80：15：5。4流 速：1.0mL/min。5柱 温：356进样量：20L。 3.5.3测定按高效液相色谱法（通则0512）测定。取系统适用性实验

28、溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。3.5.4判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。 七、变更/偏差控制：1、如验证过程中出现变更，则按变更控制程序进行。2、如验证过程中出现偏差，则按偏差控制程序进行。3、任何可接受的变更/调查/偏差和采取的措施，均应记载在下表中。4、变更/调查/偏差纪录序号变更/偏差编号问题简述是否附报告处理日期填写人/日期： 复核人/日期：QA检查人/日期：所附的变更/调查/偏差修正报告和支持文件，应作为此文件的附录部分。 八 .附件：序号附件名称填写人/日期： 复核人/日期：QA检查人/日期： 九.变更记载及原因修订号执行日期变更原因、依据及详细变更内容01XXXX首次验证。