杂质。
DNA浓度的计算：
浓度（µg/mL）=A260*50*稀释倍数；
注：
1OD值相当于50µg/mL双螺旋DNA。
（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测
将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。
（二）PCR扩增
一、PCR扩增引物
采用两组对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对：
组合（F34，GC和RS:
8）。
引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡
结构。
它们各自序列分别为:
F341:
（5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’），Rsls:
（5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，），GC发卡结构
（5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’）。
引物
组合扩增产物片段长度约为220bp。
二、PCR扩增反应体系
PCR扩增反应体系，与表3一3相同。
加样后立即进行PCR扩增。
三、PCR扩增程序
PCR扩增程序，与表3一4相同。
四、PCR产物电泳检测
取5闪PCR产物进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100v条件下电泳lh后检测，
经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。
电泳所用Marker为天根生化
科技（北京）有限公司生产的nNAM叭e:
nLZo00。
（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
预电泳的作用
1.使体系达到反应的条件
2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。
其装载的样品量大，回收DNA纯度高。
长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N'一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。
一、试剂配制
（l）50*TAE缓冲液:
242gTris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5MEDTA（pH8.0），加水至1L。
混合均匀后高压灭菌20-30min，室温保存。
（2）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：
1）：
38.93g丙烯酰胺，1.07g双丙烯酰胺，加水至100mL。
（3）O%变性溶液：
20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，加水至100mL，再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。
4℃条件下保存在棕色瓶中。
（4）100%变性溶液：
2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，40mL甲酰胺，42g尿素，加水至100mL，再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。
4℃条件下保存在棕色瓶中，100%变性溶液在使用之前需要预先溶解，把瓶子放进水浴锅中加温并快速搅拌。
（5）10%过硫酞胺（APS）：
lg过硫酰胺加水至10mL。
现用现配。
（6）对于变性浓度低于100%的溶液，用0%和100%的变性溶液混合配制而成，尿素和甲酰胺含量如下所示：
不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量
成分
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
尿素（g）
4.2
8.4
12.6
16.8
21
25.2
29.4
33.6
37.8
甲酰胺（ml）
4
8
12
16
20
24
28
32
36
二、DGGE胶的制备
（l）用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板，将spacer放在2个玻璃板之间，插入clamp中，将aligment板放入，用螺丝夹子固定，将aligment取出，用手摸底部是否平整，要绝对的平，否则会漏。
（2）将软垫放在底座上，玻璃板放在软垫上固定，用水平器调节。
（3）配制13.5mL高浓度变性梯度液，加入梯度仪高浓度右槽，打开左槽螺旋，溶液流入左槽，关上螺旋，用吸管将它们吸回右槽内（确保两槽无气泡阻隔）。
（4）配制13.5mL低浓度变性梯度液，加入梯度仪低浓度左槽。
（5）轻轻打开两槽间的活塞和梯度仪出口开关，并搅拌。
将长针头插入玻璃板之间，流速保持在2mL/min左右。
（6）胶板灌满后，顶部插入梳子，凝固2小时。
三、DGGE凝胶电泳步骤及染色
（l）在DGGE槽中加7L左右1*TAE（DGGE专用），使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖，注意长杆进入底部的窟窿中，打开电源，将温度设置到60℃，打开heat键。
（2）当梳子位置的胶凝固好后，将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上，如果只有1板胶，注意另一侧也要固定玻璃板（不加spacer），否则漏水。
安装好玻璃板后，将凝胶板架（红点在右边）放入水槽中，之后将温度控制器盖在电泳槽上，注意长杆进入底部的窟窿中。
打开电源，打开heat键和bump键，开bump键后，水位会下降，降至run与maxmum的中间，水若不够的话，关闭电源，打开温度控制器上方的探望口，加1*TAE补足。
（3）温度达到60℃，立即进样，先关掉所有电源，取下温度控制器，小心地拔掉梳子，用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢，使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。
每一个进样孔加入25µL样品。
（4）将温度控制器盖在电泳槽上，打开电源，将温度调到60℃，打开heat键和bump键，运行5min后，在主机上插入红黑电源线，注意红黑线不要颠倒。
打开主机电源，将电压调到120V，时间调为5h。
（5）电泳结束后，关掉电源，打开盖子，将凝胶板架拿出，控水，卸下玻璃板。
将clamp卸下，手抓住spacer，向内侧拧，揭下短玻璃板，胶粘在长玻璃板上。
（6）将托盘上平铺张保鲜膜后，将长板和胶放入托盘中银染。
银染步骤
步骤：
时间
溶液
固定
30min
10%冰醋酸、30%乙醇，100ml
敏化
2*10min
30%乙醇，100ml
洗涤
冲洗30s，漂洗5*5min
双蒸水
银染
30min
新鲜配制的0.1%AgNO3，100ml，使用前加入370μl的福尔马林溶液
洗涤
冲洗30s，漂洗1min，再冲洗30s
双蒸水
显影
直至显示条带为止，密切观察
溶液1：
0.2g硫代硫酸钠于10ml水中
溶液2：
2.5g碳酸钠于100ml水中
将100μl溶液1加入溶液2中，再加350μl的福尔马林溶液
终止
30min
5.84gEDTA2Na·2H2O以及8gGlycine于双蒸水中，定容至400ml（也可用10%的冰醋酸）
保存
长达数日
10%甘油
长时间保存
干胶
自然干燥即可
（1）AgNO3母液（20%）：
将2gAgNO3溶解于双蒸水中，定容至10ml，放置于棕色瓶中密闭保存。
每次使用时取2ml母液，稀释至400ml，再加入福尔马林。
（2）10*TrisEDTA（TE）：
pH=8.0
A．100mmol/LTris-CI（pH=8.0）
B．10mmol/LEDTA（pH=8.0）
C．Tris-Cl（1mol/L）：
用800ml蒸馏水溶解121.1gTris碱，加浓盐酸调pH值至所需值。
银染原理：
银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。
虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。
如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。
为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？
这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。
简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。
银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silverdiammine。
基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silverdiammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。
银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。
通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。
那最初的负染是如何演变成正染色的呢？
一方面是选用还原速度较慢的还原剂，如甲醛，另一方面，利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去，由于银离子对蛋白质有一定的结合力，故更多地保留在有蛋白的位置，于是形成了正染。
但是这种染色的方法灵敏度还不是很高，所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤，能够使银染敏化的试剂很多，一类是增加蛋白质与银离子的结合位点，如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silversulfide等结合，硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能，如戊二醛。
通过敏化过程，银染的灵敏度大大增加，同时也降低了背景。
综上，银染的原理概括如下：
让银离子尽可能多的于蛋白结合，尽可能的洗掉胶上的银离子，然后还原显色。
各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。
最为经典的一个版本是这样的：
谈谈其中一些具体步骤：
1.固定，固定的作用主要是使蛋白变性，防止蛋白在扩散
2.敏化，戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合，但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉，原因是对蛋白造成修饰（在我的实验中，有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白，不知道是不是去掉更好）。
乙酸钠的作用应该是缓冲pH。
3.染色，有的protocol中这一步不加甲醛，不加甲醛使后面的显色速度将大大降低。
4.显色，碳酸钠的作用是提供碱性环境，在碱性环境下甲醛才能发挥它的慢还原特性。
这一步中的硫代硫酸钠有增加银化合物溶解的能力，防止氯化银在胶表面形成薄膜，但是在质谱兼容银染中，硫代硫酸钠也是省去的。
5.终止，顾名思义，显色成功后终止反应。
评价好的银染方法主要基于以下几个方面：
灵敏度，重复性，速度。
个人认为平衡好灵敏度和重复性是实验的关键，速度可以放在后面考虑。
如果不知道哪个版本的银染更为合适，那么上面的那个经典版本是个不错的选择，之后可以根据具体的结果，并参考银染的原理做些优化。
通常银染方法简单，只需几步。
电泳后，在醋酸中固定胶除去电泳液和凝胶中的尿素，并防制小的延伸产物的扩散。
换几次蒸馏水除去固定剂。
胶在硝酸银和甲醛中染色。
在染色后，将凝胶用水清洗，在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色。
甲醛将银离子还原为金属银。
硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。
在显色一定的时间后，用水清洗一下，在空气中干燥。
（7）用Bio-RadGelDocTMXR凝胶成像系统观察并拍照。
（四）DGGE图谱目的条带的克隆测序
1.DGGE图谱目的条带DNA的提取与PCR扩增
将切取下来的目的条带浸泡在TE溶液中，4℃过夜，得到的溶液即可作为PCR反应的模板。
PCR反应体系与程序与之前相同，采用引物对BSF338（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和BSR534（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。
PCR反应体系（25µl）:
10×ExTaqbuffer（Mg2+）2.5µl，2.5mmol/LdNTP2µl，20pmol/L正反引物各0.75µl，模板DNA10～100ng，ExTaq0.25µl，加双蒸水补足至25µl。
PCR反应程序：
94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最终延伸10min。
扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.PCR产物的胶回收
采用E.Z.N.AGelExtractionKit，操作步骤如下：
（1）电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶。
（2）称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。
一般情况下，凝胶的密度为1g/ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：
凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的BindingBuffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3min混匀一次；
（3）转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10000×g离心1min，弃去液体；
（4）将柱子重新套回收集管中，加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中，室温下，10000×g离心1分钟，去弃滤出液；
（5）将柱子重新套回收集管中，加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室温下，10000×g离心1min，去弃滤出液；
（6）将柱子重新套回收集管中，重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室温下，10000×g离心1min，弃去滤出液；将空柱子重新套回收集管中，10000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；
（7）把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10000×g离心1min，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20℃。
3.目的DNA与pMD19-T载体的链接转化
反应体系（10μl）如下：
pMD19-T1μl，模板DNA4μl，SolutionⅠ5μl，16℃连接过夜。
连接产物的转化：
（1）把感受态细胞置于冰中融化；
（2）把100μl的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内；
（3）加入用于转化的DNA；
（4）冰中放置30min；
（5）42℃放置45～60s；
（6）冰中放置2～3min；
（7）加入37℃预温好的SOC培养基，使终体积为1ml；
（8）37℃振荡培养1h（160～225rpm）；
（9）取适量涂布琼脂平板培养基；
（10）平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置培养过夜。
4.阳性转化子鉴定及测序：
分别挑取10个白色单菌落，利用载体通用引物M13-47和RV-M鉴定转化子。
PCR反应体系（25µl）:
10×ExTaqbuffer（Mg2+）2.5µl，2.5mmol/LdNTP2µl，20pmol/L正反引物各0.75µl，ExTaq0.25µl，加双蒸水补足至25µl。
PCR反应程序：
94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最终延伸10min。
延伸40s，25~30个循环，72℃最终延伸7min，-20℃保存。
扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统检测，鉴定和筛选含有目的基因的阳性转化子。
选择阳性克隆，送交invitrogen公司完成测序。
5．序列分析与系统进化树绘制
将测序结果去除载体后，至GenBank数据库通过blastn功能进行比对分析。
聚类分析采用UPGMA算法进行分析。
16SrRNA基因进化树利用CLUSTAL_X、Phylip3.65，Mega等软件，以Neighbor-Joining法绘制系统进化树，自展评估1000次。
最终获得所需的进化树
升级会员 