细胞凋亡检测方法.docx

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细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

一、细胞凋亡的形态学检测

1 光学显微镜和倒置显微镜

（1） 未染色细胞：

凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2） 染色细胞：

姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：

正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。

苏木素-伊红（HE）染色：

细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。

2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：

Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。

三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。

Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。

但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：

Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图1）。

3 透射电子显微镜观察　　

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PI和Annexin-V双标：

碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

*注意：

细胞凋亡时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

活细胞不能被AnnexinV-FITC或PI染色（右图左下象限）。

早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈AnnexinV-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。

坏死或晚期凋亡的细胞呈AnnexinV-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。

*注意：

未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。

三、线粒体膜电位的检测

线粒体跨膜电位下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

名称

检测原理

3，3’-Dihexyloxacarbocyanineiodide

（DiOC6）

一种有细胞通透性及电压敏感性的亲脂性阳离子荧光染料，用作膜电位探针，能选择性地染线粒体及内质网

3，3’-Dihexyloxadicarbocyanineiodide

一种有细胞通透性及电压敏感性的亲脂性阳离子荧光染料，能识别发卡四重结构。

也用作端粒酶抑制剂及抗癌试剂，能在活细胞特异地染色线粒体，用于线粒体定位及鉴定其氧化能力

Rhodamine123

一种能染活细胞线粒体的有膜通透性的荧光染料，广泛用于测定线粒体膜电位，能用于检测耐药的肿瘤细胞的P-糖蛋白的流出活性。

JC-1

一种阳离子染料，用作线粒体膜电位的指示剂

注意事项　　

1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

四、DNA片断化检测　　

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。

细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成。

1.大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。

所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。

线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。

此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。

因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。

通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。

这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。

每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。

DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。

当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

2.DNALadder测定　　

3.凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析　　

4.ApoAlertTMLM-PCRLadderAssay（CLONTECH）

优点：

敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。

如临床活组织检测。

五TUNEL法　　

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1Westernblot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

2荧光分光光度计分析　　

原理：

活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。

根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。

在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。

根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

3流式细胞术分析　　

方法：

收获细胞正常或凋亡细胞?

PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC37°C反应1hUV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析　　

TFAR19（PDCD5），前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。

利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。

同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。

进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。

方法：

1悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

　　（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

　　（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

　　（5）加入5mlFITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：

40），4°C反应30min

　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm10min。

结果观察：

将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。

同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。

2：

贴壁细胞的原位染色

（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

　　（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

　　结果观察

细胞凋亡检测

1、 早期检测:

1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测

2）细胞内氧化还原状态改变的检测

3）细胞色素C的定位检测

4）线粒体膜电位变化的检测

2、 晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。

对于晚期检测通常有以下方法：

1）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）

2）LM-PCRLadder（连接介导的PCR检测）

3）TelemeraseDetection（端粒酶检测）

3、生化检测：

1）典型的生化特征：

DNA片段化

2）检测方法主要有：

琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等

3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）

4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。

可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4、LM-PCRLadder（连接介导的PCR检测）

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。

通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。

此外，LM-PCR检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

需结合其它的方法来检测细胞凋亡。

其它方法：

1）TelemeraseDetection（端粒酶检测）

端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。

正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。

研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。

2）mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。

据报道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxicTcells）等靶细胞。

Bcl-2和bcl-X（长的）作为抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。

用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。

通过检测fas,bax-alpha和bcl-X（长的）基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5、细胞内氧化还原状态改变的检测：

正常状态下,谷光苷肽（GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。

细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。

这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。

当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

6、细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。

正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后启动caspase级联反应：

细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、线粒体膜电位变化的检测：

1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系

2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。

而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。

3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道（PT孔道）能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。