蛇胆川贝枇杷糖浆限度检查操作方法.docx

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蛇胆川贝枇杷糖浆限度检查操作方法

蛇胆川贝枇杷糖浆限度检查操作方案

一般供试品的检验量10g或10ml，要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。

一般应随即抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。

对于口服给药制剂：

细菌数每1g不得超过1000cfu。

每1ml不得超过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得超过100cfu。

大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。

含蜂蜜、王浆的口服给药制剂每10g或10ml还不得检出沙门菌。

固体、半固体或黏稠性供试品  

    取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：

10的供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀.

一、抽样：

取三瓶川贝枇杷糖浆，从每瓶中各抽取10g，混匀，即共30g。

二、

计数检查

培养基的制备数量

       营养琼脂培养基：

72副皿需1440ml制备1500ml20ml/副

玫瑰红钠琼脂培养基：

52副皿需1040ml制备1200ml20ml/副

控制菌检查

胆盐乳糖培养基：

需800ml制备900ml100ml/瓶

4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）：

需45ml制备50ml5ml/管

EMB或麦康凯琼脂培养基：

需200ml制备300ml25ml/副

细菌、霉菌、酵母菌计数

三、计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种

验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC（B）44102］

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC（B）26003］

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）［CMCC（B）63501］

白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]　

黑曲霉（Aspergillusniger）　[CMCC（F）98003]　

菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在两小时内使用，若保存在2~8℃，可在二十四小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的储存期内使用。

适用性检查：

取大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌各50~100cfu,分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备两个培养皿，混匀，凝固，置30~35℃培养48小时，计数;取白色念珠菌，黑曲霉各50~100cfu,分别注入无菌培养皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备两个培养皿，，混匀，凝固，置23~28℃培养72小时，计数，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定：

若被检出的培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。

四、计数方法的验证

    当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

    验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查。

验证方法   验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

（1）试验组  平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

（2）菌液组   测定所加的试验菌数。

（3）供试品对照组  取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

   （4）稀释剂对照组   若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

  结果判断   在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。

若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

    验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

五、供试品检查

    检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。

    取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：

10、1：

100、1：

1000等稀释级。

    平皿法

    采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。

取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

 阴性对照试验  取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

 培养和计数   除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

    在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。

    菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌宜平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。

若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落乘以稀释倍数的值报告菌数，当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。

（3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

 （4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

控制菌检查

控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种  

对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

      大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44 102］

      金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］

菌液制备   

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2~8℃可在24小时内使用。

一、适用性检查

控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。

各培养基的检测项目及所用菌株见下表。

控制菌检查

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖（BL）培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

MUG培养基

促生长能力+

指示能力

大肠埃希菌

曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯（MacC）琼脂

促生长能力+

指示能力

大肠埃希菌

1.增菌培养基促生长能力检查：

分别接种不大于100cfu的试验菌（见表）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

2.固体培养基促生长能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。

3.培养基抑制能力检查：

接种不少于100cfu的试验菌（见表）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

4.固体培养基指示能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见表）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。

被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况应与对照培养基一致。

5.液体培养基指示能力检查：

分别接种不大于100cfu的试验菌（见表）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

二、控制菌检查方法的验证

    当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

    验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

菌种及菌液制备

同控制菌检查用培养基的适用性检查。

验证方法:

    取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

结果判断

若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。

若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

三、供试品检查

   供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

阳性对照试验  

阳性对照验的加菌量为10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验  

取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

大肠埃希菌（Escherichia coli）  

取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、

），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时，必要时可延长至48小时。

     取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，为MUG阴性。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

    如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

    若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。

若平板上生长的菌落与表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。

大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝（EMB）琼脂

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润

结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，其中任何一项不符合该品种的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。