蛋白质组学期末复习题.docx

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蛋白质组学期末复习题

蛋白质组学相关试题及答案

解释

1．Proteome（蛋白质组）：

由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。

2.Proteomics（蛋白质组学）：

指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。

更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能.

3.MassSpectrometer（质谱仪）：

质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/zorm/e）。

分离和检测不同同位素的仪器。

即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。

质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。

4.Proteomesampleholographicpreparation（蛋白组样品的全息制备）：

（1）keepproteininformation

（2）adaptedtoseparationandidentificationmethods

（3）differentsamples,differentextraction.

蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。

因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。

因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。

原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。

5.Posttranslationalmodification（蛋白质翻译后修饰）

肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。

已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。

6.Denovosequencing（从头测序）

从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。

其基本算法主要由4个部分组成：

质谱图的构建、离子类型的确定、测序算法以及打分算法。

7.Tandemmassspectrometry（串联质谱）

串联质谱法是指用质谱作质量分离的质谱方法。

它还有几种名称，如质谱-质谱法、多级质谱法、二维质谱法和序贯质谱法。

作用：

1、诱导第一级质谱产生的分子离子裂解，有利于研究子离子和母离子的关系，进而给出该分子离子的结构信息。

2、从干扰严重的质谱中抽取有用数据，大大提高质谱检测的选择性，从而能够测定混合物中的痕量物质。

s

8.Peptidemassfingerprint（肽指纹谱）

peptidemolecularweight肽指纹图谱，PMF，peptidemappingfingerprint,蛋白酶解后产生多个肽片断，然后利用质谱（通常用MALDI－TOF）测量这些肽段的分子量，然后上网进行蛋白谱库搜索，以确认此蛋白是何种蛋白，此为PMF。

这些肽段就像蛋白的指纹一样，有了这些肽段，就可以确认蛋白了。

9.Collision-induceddissociation（CID）（碰撞诱导解离）：

离子经过电喷雾源在进入质量检测器前，施加一定的电压，使离子的运动速度大大提高，当离子与中性分子撞击时，发生如下反应：

A++N→（A+）*→B++C++D+

10.Peptidesequencetag肽序列标签：

将蛋白质进行酶切降解做电喷雾质谱产生包括多电荷峰在内的肽质量指纹谱，选择有一定丰度的双电荷峰经气体碰撞活化池碰撞后产生碎片，其中包含着结构信息，由这些信息可以推出蛋白质的某一肽段的部分氨基酸序列测定出的部分氨基酸序列和其序列两段的质量称为肽序列标签。

11.Phagedisplaytechnology（噬菌体展示技术）：

Toallowthepresentationoflargepeptideandproteinlibrariesonthesurfaceoffilamentousphage,whichleadstotheselectionofpeptidesandproteins。

噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，他以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体

12.Two-dimensionalGelElectrophoresis双向凝胶电泳（2-DE）：

即双向凝胶电泳（2-DE），该技术是根据蛋白质的等电点和分子量的差异，连续进行垂直方向的两次电泳而将待测蛋白质进行分离。

第一向为等电聚焦（IEF）电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点的不同进行蛋白质的分离。

第二向为十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE），其基本原理是利用蛋白质分子量大小的不同进行蛋白质分离，从而把复杂蛋白质混合物在二维平面上分开。

该技术是目前蛋白质组学研究中分辨率最高，信息量最大的分离技术，是比较蛋白质组学研究中也是不可取少的手段。

13.Structuralbiology（结构生物学）：

isabranchofmolecularbiology,biochemistry,andbiophysicsconcernedwiththemolecularstructureofbiologicalmacromolecules,especiallyproteinsandnucleicacids,howtheyacquirethestructurestheyhave,andhowalterationsintheirstructuresaffecttheirfunction.以生物大分子的特定空间结构及结构的特定运动与其生物学功能的关系为基础，阐明生命现象的学科。

研究特殊分子的性质以及分子间的相互作用，如膜蛋白的拓扑学、蛋白质的二级结构中残基的接近和移动以及蛋白质的三级折叠等。

14.Protein-proteininteraction（蛋白质互作）：

（1）Proteinsmightinteractforalongtimetoformpartofaproteincomplex

（2）aproteinmaybecarryinganotherprotein（3）aproteinmayinteractbrieflywithanotherproteinjusttomodifyit蛋白质之间的相互作用。

蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥调节作用的重要方式。

15.YeastTwo-HybridAssays（酵母双杂交分析）：

amolecularbiologytechniqueusedtodiscoverprotein-proteininteractionsbytestingforphysicalinteractions（suchasbinding）betweentwoproteins酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体:

a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

16.Matrix-assistedlaserdesorption/ionization基质辅助激光解吸电离

技术（MALDI） 是以激光脉冲照射在固定于平面电极上的蛋白质分子，经平行电场加速，再由质谱仪进行分析。

以波长337nm的氮气激光脉冲击打固定于基质上的蛋白质分子，使得蛋白质从基质上游离并带上微弱的正电荷。

此时再经由高能平行电场加速提高核质比，进入质谱仪进行分析，此方式能分析带电量低的分子，以及含有许多不同种类分子的混合物

17.Subproteomics:

亚蛋白质组学

Proteinslocatedinsubcellularstructure亚细胞结构,suchasmembraneproteome

亚细胞蛋白质组学是以亚细胞结构如亚细胞区室、特定蛋白质组分、细胞器等所包含的所有蛋白质为研究对象的一个蛋白质组学的分支学科。

亚细胞结构在细胞的生命活动中都与特定的细胞功能相联系。

分离、鉴定其在不同生理状态下的蛋白质表达情况对于全面了解细胞的功能具有重要意义。

由于亚细胞蛋白质组学研究的着眼点在蛋白质组的特定成分，而非整个蛋白质组，就有效的能够有效弥补目前蛋白质组研究方法学上的不足。

即一方面可以为我们提供更多生命活动的本质、细胞功能紊乱的分子机制等信息。

另一方面多种疾病相关的基因表达产物与某些特定的细胞器相关联，直接分析这些细胞器的蛋白质表达变化，能够更容易、更快速地寻找到有诊断、治疗价值的信息。

18.ICAT:

Isotope-CodedAffinityTags

DeterminedifferencesinproteinexpressionbymeasuringrelativeTOFMSintensitiesoflightvs.heavyMS/MSandsequencetagsearching同位素标记的亲和标签（ICATs）是一种免费方法凝胶定量蛋白质组学上依赖化学标记试剂。

 [1] [2]这些化学探针元素一般包括三个：

一组定义能够反应标签的氨基酸侧链（例如， 碘乙酰胺修改半胱氨酸残基），一同位素编码的连接器和一个标签（例如， 生物素肽）的蛋白质/亲和隔离标记。

 对于两个蛋白质组定量比较，一个样品的同位素标记光（第0）探针和与同位素重（D8的）版本等。

 为了尽量减少错误，然后合并两个样本）消化蛋白酶（如胰蛋白酶，并受到素 亲和层析分离试剂标记同位素标记肽编码。

 然后分析这些肽是由液相色谱质谱（LC-MS法）。

 大规模的差异标记肽对信号强度的比率量化来确定两个样本的蛋白质的相对水平。

19.MALDITOFMS

即基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱，是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，仪器主要由两部分组成：

基质辅助激光解析电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。

MALDI的原理是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔内，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。

因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，并特别适用于对热敏感化合物或不会发化合物的离子化。

TOF的离子分离是用非磁方式达到的，离子在离子源中形成后被电场加速，进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离，先后到达检测器而产生信号。

MALDI-TOF-MS无论在理论上还是在技术上都十分简单、高效、快速、准确，并且质量测定范围大，故为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。

20.离子交换层析：

离子交换层析是利用离子交换剂对分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的。

这种亲和力是基于各种离子所带电荷的不同，对相近的生物分子带电量有差别就可达到分离的目的。

生物分子几乎都具有极性而且带电，所以离于交换层析在生化分离技术上，成为极有用的一种工具。

用离子交换剂作为支持物，或固定相，在离子交换剂上含有许多可解离的基团，这些基团可以与溶液中的离子进行交换。

离子交换的原理是基于溶液中分子所带电荷不同而进行分离的一种技术。

问答题

1、Describethemainsteps,principlesanddisadvantagesoftwo-dimensionalgelelectroporesis?

双向电泳的主要步骤和原理，缺陷与面临的挑战是什么？

主要步骤：

样品制备，双向电泳，着色或印记，图像分析，切除溶解，质谱分析，生物信息学鉴定

原理：

双向电泳的第一向是等电聚焦电泳，根据蛋白质的PI不同进行分离，第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量不同进行分离，样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。

缺陷和挑战：

（1）对低丰度蛋白质的检测来说灵敏度不够

（2）对劳动密集性的工作/费力和费时的操作程序

（3）不同实验间蛋白质所在位置的漂移

（4）不能全面代表膜蛋白或疏水蛋白的真实情况

（5）某些蛋白质在等电聚焦缓冲液中低溶解度

（6）蛋白质间着色的差异引致定量的误差

（7）碱性蛋白检测难

（8）特大分子量的蛋白质的检测难

（9）特小分子量的蛋白质的检测难

（10）蛋白质从1D电转移到2D凝胶过程中的损失

（11）某些蛋白质带电荷的微不均一性

（12）易受污染

（13）要求在变性的条件下进行

2、质谱仪的组成及其主要技术指标。

质谱仪一般由进样装置、离子化原、质量分析器、离子检测器、数据分析系统组成。

其中，离子化原用来待分析的分子转化成气态离子。

在质量分析器中，不同荷质比m/z离子在一个随时间变化的电场作用下分离。

离子检测器用来接受在质量分析器中分离的带有不同荷质比的离子检测m/z值以及不同m/z的离子密度。

主要技术指标包括：

灵敏度，分辨率，准确度，稳定性，质量范围，动态范围

3.Describethemainpartsofbiologicalmassspectruminstrument.DescribetheprincipleandpplicationofMALDI.生物质谱仪主要有哪几部分组成？

基质辅助激光解析电离的主要原理是什么？

适用于哪些方面？

质谱仪有五个主要的系统：

进样系统、离子源系统、质量分析仪、离子探测器、数据处理系统。

MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。

待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。

MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。

可得到分子分离峰，无明显碎片峰。

此电离方式特别适合于飞行时间质谱计。

4、蛋白质组学定量分析方法的主要原理。

蛋白质组学定量分析主要包括两种方法：

1、建立在2－DE基础上的电泳方法：

其原理是通过比较通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。

提供蛋白质表达水平的信息。

2、利用质谱检测技术：

对来自不同样品的肽段标上一个内部标准，使得可以识别不同样品来源的肽段，以质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。

5、免疫共沉淀的概念及原理。

Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

基本原理：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。

如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。

该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。

6、WesternBlotting的流程

第一步：

蛋白样品制备

        蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

第二步：

蛋白定量

        为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。

蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。

第三步：

电泳

（1）SDS-PAGE凝胶配制

（2）样品处理

（3）上样与电泳

第四步：

转膜

       具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

       转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效。

第五步：

封闭

       丽春红染色后可用铅笔在膜上做出适当标记，然后用预先准备好的WB洗涤液漂洗3～5min，将膜上的红色洗去。

弃去洗液后，加入10%的脱脂奶粉，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。

如背景较高，可以在4℃封闭过夜。

第六步：

孵育

1．一抗孵育

       参考一抗的说明书，按比例稀释一抗。

在室温下孵育2小时，然后用WB洗涤液漂洗膜，每次10min，共3次。

2．二抗孵育

       参考二抗的说明书，按比例稀释二抗。

在室温下孵育1小时，然后用WB洗涤液漂洗膜，每次10min，共3次。

第七步：

显色

       建议选用Pierce公司生产的ECL发光液。

第八步：

显影

       ECL发光液处理过的膜，用保鲜袋包裹后，与X光片一起置于暗合中。

根据荧光的强弱进行适当时间的曝光，取出X光片置于显影液，定影液中显影。

7.Whataretheprinciplesforproteinsamplepreparationin2-PE?

pleaseoutlinetheinterferingsubstancesinthesamplepreparation.双向电泳分析中的蛋白质样品的制备原则？

制备原则：

（1）要使用新鲜的样品或者速冻（液氮或-70）保存的新鲜样品

（2）注意防止污染（3）在合适的盐浓度下溶解所有的蛋白质，实验具有重复性；（4）避免低溶解度蛋白（膜蛋白）在第一维等电聚焦时沉淀；（5）避免蛋白化学修饰（蛋白降解酶，尿素热分解）（6）去除核酸，多糖，脂类和其它干扰物质；（7）目标蛋白在检测限内，有时需要去除高丰度蛋白（8）处理步骤尽量少，操作过程要在低温中进行，避免蛋白质的降解、修饰。

制备原则：

（1）保留蛋白质的信息

（2）适用于分离和鉴定的方法

（3）不同的样品，不同的提取方法。

（细胞、动物组织、植物组织、体液、质蛋白、膜蛋白、核蛋白、低丰度蛋白、目标蛋白）

双向电泳分析中影响样品制备的主要干扰物质有哪些？

主要干扰物质：

（1）盐：

（增加导电性，使得等点聚焦所需时间延长，出现电内渗现象（EEO），导致胶内不均匀的水分布（失水区和水过饱和区））

（2）离子去污剂（SDS）：

（影响第一维等点聚焦）

（3）核酸：

（通过静电作用与蛋白结合，妨碍聚焦过程；可阻碍丙烯酰胺基质孔道）

（4）脂类：

（通过疏水作用与蛋白结合，影响等电点及分子量，蛋白-脂类复合物在水溶性溶液中不溶解）

（5）多聚糖：

（会阻碍丙烯酰胺基质孔道）

（6）酚类复合物（植物）：

通过氢键与蛋白结合

8.蛋白质组学在心血管基础和临床研究中的目的和意义。

①从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；

②应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征（ACS）；

③蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；

④蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；

⑤蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。

9.层析法的概念和分类

（一）定义

层析分离技术（色层法）：

是一种物理分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的，称为固定相，另一相则流过此固定相，称流动相，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。

将分离的样品加到柱上（层析介子上）称上样或加样；使样品分离的操作叫洗脱，洗脱的溶剂叫洗脱液，也称流动相。

以洗脱液的体积为横坐标，组兮的浓度为纵坐标作图，称洗脱曲线或层析图。

（二）层析法分类

根据分离原理分类：

（1）吸附层析：

用吸附剂作为支持物，一种吸附剂对不同的物质有不同的吸附能力。

在洗脱过程中，不同物质在柱上的迁移速度不同，在最后完全被分离。

（2）分配层析：

它是根据在一个有不同组分同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而设计的一种层析方法。

（3）离子交换层析：

用离子交换剂作为支持物，或固定相，在离子交换剂上含有许多可解离的基团，这些基团可以与溶液中的离子进行交换。

离子交换的原理是基于溶液中分子所带电荷不同而进行分离的一种技术。

（4）凝胶层析：

用一种具有一定孔径大小凝胶颗粒为支持物的层析法，分子大小不同的物质随洗脱液流过柱床时，分子量大于凝胶孔径的物质不能进入胶中而首先被洗脱，分子量小的进入胶中流程长而后被洗脱。

因此这是一种根据分子量大小不同进行分离的方法。

（5）亲和层析：

这是专门用于分离生物大分子的层析法。

它是利用一种特殊吸附剂作固定相，根据溶液中生物分子化学结构与功能的不同进行选择性的（专一性的）及可逆性吸附，通过适当方法进行解吸附。

实际也是一种吸附层析。

举例题

1、请列举预测蛋白质相互作用的方法。

1、酵母双杂交法：

主要原理是将可能存在相互作用的蛋白之一与Gal4的DB结构域融合。

另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。

如果在两个待测蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。

通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

2、免疫共沉淀法：

免疫共沉淀是一种比较经典的蛋白质相互作用方法，其实验比较简单。

裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性亲和再分析结合复合体。

目前常使用Pull－down实验结合免疫共沉淀可以对可能的蛋白质相互作用进行验证。

3、高通量质谱蛋白质鉴定：

使用一分子标签如FLAG标记把蛋白，使融合蛋白在细胞内过表达。

通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中把蛋白形成的蛋白质复合物。

SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。

此法适合于分析天然状态下细胞内浓度较低的蛋白质，但是如果蛋白质浓度过高则背景较强，产生假阳性。

4、串联亲和纯化（tandemaffinitypurification,TAP）：

该技术核心是设计一个双重分子标签，包括A蛋白（IgGbindingprotein）、TEV蛋白酶切位点、钙调素结合蛋白。

将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近把蛋白的天然状态。

可以与把蛋白相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。

细胞裂解物和IgG基质温浴在一起，通过A蛋白复合物结合在IgG上。

冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱复合物。

在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被钙调素的温育在一起，复合物就结合在珠子上。

进一步洗去杂质后，加入EGTA鳌合，复合物脱落。

SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶切割后进行质谱分析。

该方法检测到的蛋白质相互作用更加接近自然条件下蛋白质的性质，包括浓度，定位和翻译后修饰。

适合于检测大量蛋白质之间的相互作用而形成的复合物，而不局限在两个蛋白质之间相互作用。

但是不能检测蛋白质复合物形成的顺序。

需要与酵母双杂交等方法互补。

论述题

1.Describethedifference