重组体的筛选和鉴定_精品文档.ppt
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筛选（筛选（Screening）遗传表型（遗传表型（phenotype）：
）：
是生物体遗传组成同环境是生物体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。
相互作用所产生的外观或其他特征。
nn本章教学目的和要求：
本章教学目的和要求：
本章教学目的和要求：
本章教学目的和要求：
掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（联免疫吸附测定（ELISAELISAELISAELISA）和免疫印迹（）和免疫印迹（）和免疫印迹（）和免疫印迹（WesternWesternWesternWesternblottingblottingblottingblotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道基因筛选法。
基因筛选法。
基因筛选法。
基因筛选法。
nn重点：
重点：
重点：
重点：
常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（疫吸附测定（疫吸附测定（疫吸附测定（ELISAELISAELISAELISA）nn难点：
难点：
难点：
难点：
免疫印迹（免疫印迹（免疫印迹（免疫印迹（WesternBlottingWesternBlottingWesternBlottingWesternBlotting）法的原理）法的原理）法的原理）法的原理n转化子转化子：
接纳载体或重组分子的转化细胞。
：
接纳载体或重组分子的转化细胞。
n非转化子非转化子：
未接纳载体或重组分子的转化细胞。
：
未接纳载体或重组分子的转化细胞。
n重组子重组子：
含有重组：
含有重组DNADNA分子的转化子。
分子的转化子。
n非重组子非重组子：
仅含有空载载体分子的转化子。
：
仅含有空载载体分子的转化子。
n期望重组子期望重组子：
含有目的基因的重组子。
：
含有目的基因的重组子。
n非期望重组子非期望重组子：
不含有目的基因的重组子。
：
不含有目的基因的重组子。
11抗药性标记及其插入失活选择法抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因质粒上有两个抗生素抗性基因:
Tetr和和Ampr。
Tetr上有插入位点上有插入位点BamHI和和SalI;Ampr上有插入位点上有插入位点PstI。
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体一、利用载体提供的表型特征筛选重组体原理：
原理：
8.18.1遗传学检测法遗传学检测法pBR322外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子（ampstetr）空载体空载体（amprtetr）插入子插入子（ampstets）野生型的野生型的E.coli（ampstets）导导入入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子（ampstetr）空载体空载体转化子转化子（amprtetr）影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体空载体转化子转化子（amprtetr）因插入外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为而导致基因失活的现象称之为插入失活效应插入失活效应。
对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
（1）四环素抗性基因）四环素抗性基因Tetr：
（2）氨苄青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因Ampr：
pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。
）（蓝灰色）褪色。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
（3）环丝氨酸：
）环丝氨酸：
选择过程：
选择过程：
如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
反而被环丝氨酸杀死。
（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基氨苄青霉素抗性插入失活选择过程氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。
指示液选择。
2.蓝白斑筛选蓝白斑筛选法法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色原理：
原理：
载体载体上有一段上有一段-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的）的）的）的片段片段片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。
的插入位点。
的插入位点。
的插入位点。
受体菌受体菌受体菌受体菌基因组基因组基因组基因组中有突变的中有突变的中有突变的中有突变的-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺失）片段缺失）片段缺失）片段缺失）。
可以被。
可以被。
可以被。
可以被IPTGIPTG诱导表达。
诱导表达。
诱导表达。
诱导表达。
载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
半乳糖苷酶。
半乳糖苷酶。
半乳糖苷酶。
假阳性：
假阳性：
如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有的倍数并且没有中止密码；（不破坏中止密码；（不破坏肽）。
肽）。
选择过程选择过程-半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
分解成兰色产物。
蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落筛选白色菌落3.噬菌斑筛选噬菌斑筛选法法噬菌斑（plaque）噬菌斑是指在噬菌斑是指在宿主细菌的菌宿主细菌的菌苔上，噬菌体苔上，噬菌体使菌体裂解而使菌体裂解而形成的空斑。
形成的空斑。
筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因筛选植物转化细胞常用的报告基因nn报告基因（报告基因（报告基因（报告基因（reportergenereportergene）：
系指其编码产物能够：
系指其编码产物能够：
系指其编码产物能够：
系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
活性的一类特殊用途的基因。
活性的一类特殊用途的基因。
活性的一类特殊用途的基因。
4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因（11）大大肠杆菌的杆菌的-D-葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶（-D-glucuronidase，GUS）；）；（22）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）；）；（33）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因（GreenFluorescentProtein）。
）。
报道基因（报道基因（reportergene）（44）其它）其它几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原理4-甲甲-D-葡萄糖苷葡萄糖苷酸酸荧光产物荧光产物GUSGFP紫外光照紫外光照发绿色荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUSFirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATP转入萤火虫转入萤火虫的的luciferase的烟草的烟草GFP-Kac的狗GFP老鼠GFPAlba發青綠光芒的兔子nn新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（NPTNPTNPTNPT）抗新霉素、卡抗新霉素、卡抗新霉素、卡抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和G418G418G418G418等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。
植物转化子的选择标记基因。
植物转化子的选择标记基因。
植物转化子的选择标记基因。
nn潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（HPTHPTHPTHPT）赋予转化子能抗赋予转化子能抗赋予转化子能抗赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。
转化子。
转化子。
转化子。
潮霉素是致癌物质潮霉素是致癌物质潮霉素是致癌物质潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
，操作时应慎重。
，操作时应慎重。
，操作时应慎重。
nn氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（CATCATCATCAT）也被用于筛选动也被用于筛选动也被用于筛选动也被用于筛选动植物转化子的标记基因。
植物转化子的标记基因。
植物转化子的标记基因。
植物转化子的标记基因。
-葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（GUSGUSGUSGUS）nnGUSGUSGUSGUS的基因产物的基因产物的基因产物的基因产物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶（GUSGUSGUSGUS）能够催化）能够催化）能够催化）能够催化4-4-4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-D-D-葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生葡萄糖苷酸，产生荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质4-4-4-4-甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含甲基伞形花酮，以此筛选含GUSGUSGUSGUS基因的转化子。
基因的转化子。
基因的转化子。
基因的转化子。
nn由于植物细胞由于植物细胞由于植物细胞由于植物细胞GUSGUSGUSGUS本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。
筛选植物转化子。
筛选植物转化子。
筛选植物转化子。
nn尤其是尤其是尤其是尤其是GUSGUSGUSGUS基因的基因的基因的基因的3333端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有有有有
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