易损斑块论文前列腺素E1对兔动脉粥样硬化易损斑块的稳定作用与机制研究.docx

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易损斑块论文前列腺素E1对兔动脉粥样硬化易损斑块的稳定作用与机制研究

易损斑块论文：

前列腺素E1对兔动脉粥样硬化易损斑块的稳定作用及机制研究

【中文摘要】背景动脉粥样硬化（AS）易损斑块破裂及继发血栓形成,造成血管闭塞,引起大量的心脑血管临床事件,因此,稳定易损斑块对于治疗AS疾病意义重大。

易损斑块具有薄的纤维帽,大的脂质核心以及大量炎症细胞浸润等明显特征。

其中,氧化应激引起的炎症反应是造成斑块易损性增加,易于破裂的关键性因素。

研究表明,他汀类药物除了明显的降脂作用之外,还存在显著的抗氧化应激和抑制炎症反应等多效性作用,是临床治疗AS的有效药物之一,然而此类药物存在的不良反应使其临床应用受到一定程度的限制。

前列腺素E1（PGE1）是一种高效、安全的生物活性物质,具有舒张血管、抑制血小板聚集、降低血液黏度等作用,因此临床用于治疗动脉硬化性闭塞症。

近年的研究发现,PGE1具有显著的抗氧化应激和抑制炎症反应等作用。

然而,PGE1是否能够稳定AS斑块,目前缺乏直接的证据。

因此,本研究拟在兔动脉粥样硬化模型中研究PGE1对于易损斑块的作用,并且初步探讨其作用机制。

（1）建立动脉粥样硬化易损斑块的动物模型；

（2）选择辛伐他汀作为阳性对照药物,研究PGE1对易损斑块的疗效及其量效关系；（3）初步探讨PGE1对易损斑块的作用机制。

方法1.易损斑块模型的建立：

50只2月龄雄性新西兰大白兔,高脂喂养（1%胆固醇）喂养2周后,进行腹主动脉球囊损伤术,术后继续高脂喂养至9周末,随机分为五组,分别为模型组、低剂量PGE1组（0.3μg·kg-1·-day-1）、中剂量PGE1组（0.6μg·kg-1·day-1）高剂量PGE1组（1.2μg·kg-1·day-1）和辛伐他汀组（5mg·kg-1·day-1）,同时改为普通饮食,13周末所有兔进行药物触发,处死兔后进行病理研究。

2.体重检测：

分别在实验开始、9周末和13周末,对所有兔称量体重。

3.血液生化指标检测：

分别在实验开始、9周末和13周末,经耳缘静脉采血,留取血清测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。

4.组织病理学检测：

留取腹主动脉标本,观察斑块和血栓形成的分布状况。

利用HE染色,观察斑块形态学特征,测量斑块纤维帽厚度、血管内-中膜厚度,并计算纤维帽厚度／血血管内-中膜厚度的比值。

5.易损指数：

分别利用油红O和天狼猩红染色观察斑块内脂质和胶原的分布状况。

应用RAM-11及a-actin抗体分别测定斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞的分布情况。

巨噬细胞、脂质、平滑肌细胞以及胶原的含量表示为染色阳性区域占斑块面积的百分数,易损指数=（RAM11十油红O）染色阳性百分比/（a-actin+天狼猩红）染色阳性百分比的比值。

6.免疫组织化学染色：

应用单克隆抗体,对斑块内的MMP-1和MMP-9进行免疫组织化学染色。

7.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：

检测血管组织MCP-1,MMP-1以及MMP-9的mRNA的表达水平。

8.统计学分析：

采用统计学软件SPSS13.0进行数据分析,计量资料应用x±s表示。

并用one-sampleKolmogorov-Smirnovtest评价定量资料是否呈正态分布。

连续性变量两组间比较用非配对t-检验,多组间比较用单因素方差分析。

P<0.05被认为有统计学差异。

结果1.实验动物一般情况：

共有7只兔未完成实验,2只死于麻醉意外,3只死于腹泻,2只死于呼吸道感染。

13周末各组兔的存活情况为：

模型组9只,小剂量PGE1组8只,中剂量PGE1组9只,高剂量PGE1组9只,辛伐他汀组8只。

2.各组兔体重：

与基础状态比较,9周末与13周末兔体重显著增加（p<0.01）,9周末与13周末兔体重比较无显著差异。

各时段组间比较差异无统计学意义。

3.血脂水平：

与基础状态比较,9周末兔血脂TC、TG、HDL-C、LDL-C均显著增高（p<0.01）；13周末,各治疗组血脂水平与模型组比较,PGE1各组对血脂影响未达到统计学差异,辛伐他汀组TC、TG、LDL-C均显著降低（p<0.01）,而HDL-C显著升高（p<0.05）；PGE1三组间比较无显著性差异。

4.病理学检测：

五组兔腹主动脉内膜均见浅黄色斑块样突起,散在或融合成片,与模型组比较,各治疗组斑块大小和厚度均减小。

模型组可见斑块破裂处附着血栓,说明本实验成功的建立了易损斑块兔模型。

病理学测量结果显示,与模型组比较,各治疗组斑块纤维帽厚度均明显增加（P<0.01）,其中PGE1中剂量组与辛伐他汀组纤维帽厚度无差异,而PGE1高剂量组纤维帽厚度却显著高于辛伐他汀组（P<0.05）；与模型组比较,各治疗组内-中膜厚度显著减少（P<0.01）,结果纤维帽厚度／内-中膜厚度的比值明显升高（P<0.01-0.05）,高剂量PGE1与辛伐他汀作用类似；PGE1三个剂量组间具有剂量依赖性。

5.易损指数：

与模型组比较,各治疗组斑块中巨噬细胞和脂质的含量显著降低,平滑肌细胞和胶原的含量明显升高,结果斑块的易损指数显著降低（P<0.01）；高剂量PGE1的作用强于辛伐他汀（P<0.01）,且PGE1各治疗组间具有剂量依赖性。

PGE1高剂量在降低巨噬细胞含量,增加平滑肌细胞和胶原含量方面,作用尤为显著（P<0.01）。

6.免疫组织化学染色：

与模型组比较,各治疗组斑块中MMP-1和MMP-9的表达量均显著减少（P<0.01）；高剂量PGE1降低二者表达的作用显著强于辛伐他汀（P<0.01-0.05）,且PGE1三个剂量组间具有剂量依赖性。

7.RT-PCR：

与模型组比较,各治疗组MCP-l、MMP-1、MMP-9mRNA表达明显减少（P<0.01）；高剂量PGE1的作用最为显著（P<0.01-0.05）,PGE1三个剂量组间具有剂量依赖性。

结论1.通过高脂饮食、内皮损伤以及药物触发的方法可建立易损斑块动物模型,具有与人类AS病变类似、建模时间短、适于药物干预的特征。

2.低、中、高剂量PGE1均能稳定易损斑块,具有剂量依赖性。

其中,高剂量PGE1稳定斑块的作用强于辛伐他汀。

3.PGE1对血脂没有影响,PGE1主要通过抑制斑块中巨噬细胞的累积以及炎症因子的分泌稳定易损斑块。

【英文摘要】BackgroundDisruptionandthrombosisofatheroscleroticplaquescausemostvasculardisease,whichwerepotentiallylife-threatening.Recentstudiesfocusingonpromotingplaquestabilitymayhelpdevelopausefulstrategyofproventingvascularevents.Vulnerableplaques,whichareparticularlysusceptibletodisruption,aregenerallycharacterizedasthosehavinglargelipidcore,thinfibrouscapandabundantmacrophagesinfiltration.Itisallknownthattheinflammatoryreactioncausedbyoxidativestressplaysacrucialroleinthedevelopmentand/ordestabilizationofatheroscleroticplaques.Statins,asaclassofloweringcholesteroldrugs,weredemonstratedtohavepotentialanti-oxidativeandanti-inflammatorypropertiesinstabilizingvulnerableplaques.However,liverdysfunctionandmyopathyassideeffectsofstatintherapylimittheirclinicalusefulness.ProstaglandinE1（Alprostadil,PGE1）,apotentvasodilatorandaninhibitorofplateletaggregation,hasbeenshowmaximumtherapeuticpotentialinpatientswithperipheralarterialocclusivedisease.RecentresultsrevealedthatPGE1hasobviousanti-oxidativeandanti-inflammatoryactivity.However,nodirectevidencewasprovidedabouttheeffectsofPGE1onstabilityofatheroscleroticvulnerableplaques.Thisstudy,therefore,wasconductedtoexaminetheeffectsandmechanismsofPGE1onatheroscleroticvulnerableplaquesinrabbitmodel.s

（1）Toestablishananimalmodelofatheroscleroticvulnerableplaques.

（2）TotestthehypothesisthatPGElpromotedthestabilityofvulnerableplaquedose-dependently.SimvastatinwaschosenasatherapeuticstandardtocomparewithdifferentdosesofPGEl.（3）ToelucidatethemolecularmechanismofPGE1instablizingvulnerableplaques.Methods1.Establishmentoftherabbitmodelofvulnerabilityplaque:

FiftymaleNewZealandWhiterabbitswerefeda1%cholesteroldiet2weekspriortoand7weeksafterballooninjuryoftheabdominalaorta.Attheendofweek9,therabbitswereswitchedtoregulardiet,andrandomlydividedinto5groupsfortreatmentfor4weeks:

controlgroupthatreceivednotreatment,low-dosePGE1groupthatreceivedintravenousinjectionPGElof0.3μg-kg-1·day-1,moderate-dosePGE1groupthatreceivedintravenousinjectionPGE1of0.6μgkg·day-1,high-dosePGE1groupthatreceivedintravenousinjectionPGE1ofl.2μgkg’·day-1,andsimvastatingroupthatreceivedoralsimvastatinof5mg·kg·day-1,respectively.Attheendofweek13,allrabbitsunderwentpharmacologicaltriggeringwithChineseRussell’svipervenomandhistamine.Thenallrabbitsweresacrificedforpathologicalstudies.2.Bodyweight:

Atthebaseline,week9andweek13,bodyweightofallrabbitswasmeasured,respectively.3.Serumlipidassay:

Atthebaseline,week9andweek13,Serumlevelsoftotalcholesterol（TC）,triglycerides（TG）,high-densitylipoproteincholesterol（HDL-C）andlow-densitylipoproteincholesterol（LDL-C）weremeasuredbyenzymaticassays.4.Histopathologicalanalysis:

TheabdominalaortawereprocessedandexaminedbyHEstain.Thefibrouscapthickness,intima-mediathickness（IMT）andtheratiooffibrouscapthicknesstoIMTweremeasured.5.Thevulnerabilityindex:

Thecontentoflipidsandcollagesinplaqueswereexaminedbyoil-redOandsiriusredstaining;thecontentofmacrophagesandSMCswereexaminedbyRAM11anda-actinimmunohistochemicalstaining.Thevulnerabilityindexwascalculatedbythefollowingformula:

（macrophage%+lipid%）/（smoothmusclecell%+collagen%）.6.Immunohistochemicalanalysis:

ImmunohistochemicalstainingwasperformedandtheexpressionsofMMP-1andMMP-9weredetected.7.RT-PCRassays:

ThemRNAexpressionsofMCP-1,MMP-1andMMP-9intheabdominalaortatissuewereanalyzedusingRT-PCRtechnique.8.Statisticalanalysis:

StatisticanalysiswereperformedusingthewithSPSSv13.0.Quantitativevariablesareexpressedasmean±SDandshownbyone-sampleKolmogorov-Smirnovtesttobeinnormaldistribution.Thedatawereanalyzedbyaone-wayANOVAandunpairedStudent’st-test.AP<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.Results1.Generalstateoftheexperimentalanimals:

Sevenrabbitsdidnotcompletethestudy.Tworabbitsdiedduringanesthesia,threediedofhighcholesterolinduceddiarrheaandtwodiedofrespiratoryinfection.Datawereavailableforanalysisforninerabbitsinthecontrolgroup,eightinlow-dosePGE1group,nineinmoderate-dosePGE1group,nineinhigh-dosePGE1groupandeightinsimvastatingroup.2.Bodyweight:

Bodyweightofrabbitsatweek9andweek13weresignificantlyhigherthanthatatbaseline（bothp<0.01）.Therewasnosignificantlydifferencebetweenallrabbitsatweek9andweek13,andtherewasnosignificantlydifferenceinallthetreatmentgorupsbytheendof13week.3.Serumlipidprofile:

Serumlipidprofileatweek9andweek13weresignificantlyhigherthanthatatbaseline（allp<0.01）.Attheendofweek13,theserumlevelsofTC,TG,HDL-CandLDL-CinPGE1groupsoflow,moderateandhighdosedidnotexhibitsignificantlydifferenceascomparedwiththecontrolgroup.TherewerenosignificantdifferencesamongthethreegroupsofPGE1.ThusPGE1didnotaltertheserumlipidlevelsinatheroscleroticrabbits.4.Histologicalevaluation:

Agreatquantityofwidespreadorscatteredfattyplaquewereseeninallgroupsofrabbit,thereweredisruptionandthrombosisofatheroscleroticplaquesingroupcontrol.Incomparisonwiththecontrolgroup,alltreatmentgroupsshowedsignificantlythickerfibrouscapoftheabdominalaorticplaques（allp<0.01）.However,thefibrouscapthicknesswashigherinhigh-dosePGE1groupthanthatinsimvastatingroup（p<0.05）,andtherewasnosignificantdifferencebetweenmoderate-dosePGE1groupandsimvastatingroup.TheaorticIMTwasremarkablythinnerinalltreatmentgroups（allp<0.01）.Consequently,theratiooffibrouscapthicknesstoIMTwassignificantlylargerinalltreatmentgroupsthaninthecontrolgroup（p<0.01～0.05）,anddidnotdifferfromthatinthehighdosePGE1groupandsimvastatingroup.Thereweredose-dependentdifferenceinthreePGE1groups.5.Thevulnerabilityindex:

PGE1significantlydecreasedtheplaquecontentsoflipidandmacrophages,andincreasedtheplaquecontentsofSMCsandcollagen.Consequently,thevulnerabilityindexofplaquewassignificantlyreducedinfourtreatmentgroupscomparedwiththecontrolgroup（allp<0.01）.Thevulnerabilityindexwaslowerinthehigh-dosePGE1groupthanthatinthelow-dosePGE1groupandsimvastatingroup（bothp<0.01）.Thus,PGE1dose-dependentlyreducedthevulnerabilityindexofplaqueandhigh-dosePGE1wasmoreeffectiveinreducingtheaccumulationofmacrophagesandincreasingthecontentsofSMCsandcollageninplaques.6.Immunohistochemicalanalysis:

TheexpressionlevelsofMMP-1andMMP-9werelowerinplaquesofalltreatmentgroupsthaninthecontrolgroup（allp<0.01）.High-dosePGE1wasmoreeffectivethansimvastatin（p<0.01,p<0.05）.Thereweredose-dependentdifferenceinthreePGE1groups.7.RT-PCR:

ThemRNAexpressionlevelsofMCP-1,MMP-1andMMP-9werelowerinplaquesofalltreatmentgroupsthaninthecontrolgroup（allp<0.01）.withthelevelinmoderate-dosePGE1groupbeingsimilartoth