HZ27抑制786O 细胞的迁移实验研究.docx

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HZ27抑制786O细胞的迁移实验研究

本科毕业论文

题目HZ27抑制786—O细胞的迁移实验研究

学院

专业化学制药

班级

学号

学生姓名

指导教师

完成日期

摘要：

目的研究HZ27药物对于肾癌786—O细胞迁移的影响。

方法本实验通过采用肾癌786—O细胞培养方法培养细胞，肾癌786—O细胞传代方法使细胞增殖，肾癌786—O细胞的Transwell的实验观察细胞的迁移变化以及肾癌786—O细胞的免疫印迹等方法检测细胞中Rac蛋白的变化情况。

结果药物HZ27抑制Rac蛋白的表达，从而抑制肾癌786—O细胞的活性，使其细胞转移能力降低。

结论通过研究不同剂量的HZ27药物对细胞中蛋白质Rac的表达进行抑制来达到肾癌细胞迁移能力抑制的结果，证明Rac蛋白可以抑制肾癌786—O细胞的迁移。

关键词：

肾癌786—O细胞；细胞培养；细胞传代；Transwell实验；免疫印迹实验

Abstract:

Objectivetostudythe effectof HZ27drug for renalcellcarcinomain786-O cellmigration.Methodsofthisexperimentthrough786-O cell culturemethodof cell, renalcellcarcinomain786-O methodofcellpassage cellproliferation,Kidneycancer786-OTranswellexperimentalobservationsofcellmigrationchanges and renalcellcarcinomain786-Ocells immune blotting detection Changes ofRacproteinincells.Resultstheexpressionof HZ27 drugs inhibitRacexpression, therebyinhibiting renalcellcarcinomain786-Ocells, reducethe celltransfer ability.Conclusion inhibition toachieve renalcarcinoma cellmigration inhibitionresults throughtheexpressionofHZ27 doseofthestudydrug onprotein inRaccells.Racprotein caninhibitthemigrationof proven renalcellcarcinomain786-Ocells.

Keywords:

Kidney786—Ocell;Cellculturemethod;Cellextendthemethod;Transwellmigrationexperiment;Westernblot

目录

1前言1

2实验部分3

2.1实验仪器及试剂3

2.2肾癌786—O细胞的培养实验3

2.3肾癌786—O细胞的传代实验4

2.4肾癌786—O细胞的Transwell迁移试验4

2.5免疫印迹法检测肾癌786—O细胞中蛋白Rac表达实验4

3结果与讨论5

3.1Rac转染786—O细胞5

3.2细胞活性5

3.3Transwell迁移试验5

3.3.1细胞迁移定性分析5

3.3.2细胞迁移定量分析6

3.4免疫印迹试验8

4结论8

参考文献9

谢辞10

HZ27抑制786—O细胞的迁移实验研究

医药化工学院化学制药专业学生：

指导教师：

1前言

目前，我国有数据统计国家泌尿系统肿瘤患者中，肾细胞癌患者人数仅低于膀胱癌患者人数，居于第二位，可以见得我国肾癌患者的发病率是非常高的。

而这些癌症患者中患恶性肿瘤的成人占到百分之二，小孩患恶性肿瘤概率高达百分之二十，这引起了社会广大人士的关注。

肾癌的发病率非常高，所以早在一百年前就有人对肾癌发病率做了统计。

美国的科学家Katz等[1]在他们的报告中记录了从1935年到1989年的肾肿瘤发病人数。

他们发现10万患有肾肿瘤的男性中肾癌发病人数从1.6万人次增长到9.6万人次,10万患有肾肿瘤的女性中肾癌发病人数从0.7万人次升至4.2万人次，相比之下男性患病人数远远高于女性，这五十几年间肾癌发病率有着明显的增长趋势。

而究其原因这也许和科学技术的不断进步脱不了关系，但增长数据如此之大也可以见得肾癌问题日益严峻。

当然，由于各国各族各个地区的人们生活习性以及生活方式有所不同，肾癌的发病率也是各有千秋的。

曾有数据显示，亚洲人的肾癌发病率比欧洲美洲非洲等地区低。

近年来，我国对于肾癌患病人数做了以下统计：

男性患病人数是女性的二倍；由于体检普及及医疗水平不断进步，无症状肾癌的比重大大提高。

从肾癌的发病率我们可以得出以下结论：

研究彻底治疗肾癌方法刻不容缓。

肾癌最可怕之处便是它容易发生转移，这就决定了它死亡率的高低。

有报告显示：

类似于肾癌发病率，亚洲人的肾癌死亡率也比欧洲美洲非洲等地区低，这可能与遗传因素有关。

由于肾癌患者在肾癌初期很少有发生临床症状，百分之九十的患者很难察觉到自己患了疾病。

一般地，如果患者出现腰背酸痛，肚子胀痛以及尿血等症状时，那这个病人也就有可能已经是肾癌晚期[2]。

我国2009年做过调查，在十万男性患者中死亡人次有2.37万，十万女性患者这死亡人次有1.41万[3]。

此结果显示男性患者死亡率略高于女性患者，且肾癌死亡率较高。

现如今，医疗设备不断提高，医疗手段不断进步，体检系统的不断完善，让我们喜而乐见的是肾癌死亡率正在不断下降。

对待肾癌，我们应该做到早预防，早发现，早治疗。

肾癌导致死亡的最主要因素是其非常容易发生转移，而它转移的途径和部位影响了患者的存活。

肾癌的第一种传播途径是通过直接浸润来传播：

肾细胞癌在中晚期会不断变大，刺出肿瘤外膜向周围扩大，外向突破其包膜压迫到与肾相近的肝，脾以及肾上腺，结肠等器官和组织，内向则浸润到肾盂。

第二种途径是通过淋巴途径来传播转移，其中约四分之一的肾癌是经过这条途径传播：

肾癌逐渐长大，右侧扩张到肾门周围、主动脉下腔静脉前或间淋巴结，左侧触及到主动脉前及它左侧的淋巴结，部分也可到达主动脉前乃至转移到人体肺部。

肾癌最重要的传播途径便是血液运输转移：

肾癌细胞扩大触碰到静脉，沿着毛细血管、肾内部静脉延伸到肾静脉，它在静脉中形成瘤栓，从而可以转移到静脉进入右心房之中，之后从心房中运用血运转移扩散到骨骼，肺以及其他器官。

综上所述：

肾癌转移部位有骨，肝，淋巴结，肺等。

对于早期肾癌经过手术治疗治愈后复发率较低，平均百分之二十左右，因此这类患者应该多注意复诊；经调查中期或晚期的肾癌在治愈之后复发率比较高，占到一半以上比例，因此这类患者应每隔三个月去医院复诊一次，及时吃医生开的药，注意均衡营养等。

致使肾癌发病的原因多种多样，至今尚未完全了解。

其中吸烟、喝酒、高血压、肥胖以及遗传等都是肾癌发病的病因。

下面就抽烟、激素和输血三种病因对肾癌发病进行分析。

Tavani等[4]对1989到1991年间的包括中国，美国等国家的部分癌症病人进行调查，吸烟者较容易发生肾癌，他们患上肾癌的相对危险因素（RR）=2。

大多数报告显示吸烟导致人们患上肾癌的原因是烟草，大多数的烟草是可以致癌的，上述报道中男性肾癌患者多于女性最主要的原因也是男性吸烟人数比女性多。

也许人们不知道有很多激素在人体中是可以引发癌症的，比如说仓鼠用己烯雌酚可形成肾皮质癌，人们可以从食物中获取钙元素减少肾癌发生的概率。

令人难以理解的便是输血有可能导致肾癌，虽然这个病因有待肯定，但是瑞典有关报告出21例的肾癌患者，其中曾有过输血历史的人发生肾癌的危险性提高了百分之二十。

Prineas等[5]对美国多位妇女进行了多变量统计分析,有输血史在1993年时随访38例肾癌患者五年后RR=2.5，但在八年之后RR=1.5，而不能肯定是否曾经有输血过的患者RR却更高。

所以输血这个病因还有待确定。

肾细胞癌常采取手术切割法治疗。

它是一种将原发肿瘤及它转移灶部位完全切除的方法，目前较适用于肾癌中早期患者，对治疗肾癌有着至关重要的作用。

近年来，肾细胞癌治疗方法的研究有了一定的进展。

其中数免疫治疗肾癌，化学药物治疗肾癌的研究较为突出。

由于肾癌细胞具有强大的免疫原性，它可以诱使宿主细胞产生免疫反应，增强患者的机体免疫能力，从而帮助患者缓和肾癌对身体的影响，以抑制肾癌细胞的转移。

而使用化学药物治疗肾癌则是采用例如氮芥类，铂类，抗叶酸抑制剂等细胞毒药物来治疗肾癌。

研究表明，将细胞毒药物联合使用，比如采用长春花碱与其他药物联合使用治疗肾癌的效果高于细胞毒药物的单一使用，但其毒性较高，不值得提倡。

本文研究的是HZ27抑制肾癌786—O细胞的迁移。

肾癌786—O的相关蛋白Rac介导肿瘤转移的研究有很多。

Itoh等[6]研究员曾运用了实时对单细胞进行观察的单分子技术研究了Rac蛋白对细胞移动的影响,由此观察到在移动细胞里对于Rac的探测定位正不断的发生着改变，而且Rac在细胞膜前面不断聚集,当细胞改变移动方向时,Rac1的表达就迅速地减少。

这个实验研究表明它与细胞转移是有一定联系的。

以下便谈谈关于它介导肿瘤转移的机制：

前文中已描述肿瘤转移是原发肿瘤不断长大扩张到其他部位的过程。

实验研究发现，Rac在多种人类常得的肿瘤中呈现高表达现象，它对于细胞骨架结构的调节有一定辅助作用，当某些例如是表皮生长因子等生长因子对细胞膜相应受体有作用时，它便会活化以致调节纤维细胞形成片层伪足（与细胞运动能力有关）[7]。

而形成片层伪足的事件也就是Rac介导肿瘤转移的早期研究过程[8]。

吴明富等[9]的研究报告证实,Rac1在人肿瘤转移中有关键影响。

综上所述，研究某种化合物药物以抑制Rac蛋白的作用，从而阻止它介导肿瘤转移是一种必然趋势。

在本次试验中采用的化合物是HZ27，前期实验中已经证明了这种化合物可以抑制肿瘤细胞的增殖，控制它的增长速度，但是肿瘤最大的危害就是它是否会发生转移，即这种药物是否可以控制恶性肿瘤。

那么它是否对于肿瘤细胞迁移有抑制作用呢？

这还是一个有待探究的问题，值得深思。

药物抑制肿瘤细胞迁移是一种复杂的过程，需要探究实验得出结论，以下通过免疫印迹法与Transwell试验等考察方法来进行探究。

2实验部分

2.1实验仪器及试剂

实验仪器：

无菌培养皿，培养瓶，37℃，5%二氧化碳培养箱，超净工作台，显微镜，镊子，离心机，巴氏吸管，酒精灯，Transwell小室，棉签，电泳仪，蛋白检测试剂盒，Odyssey红外荧光成像仪

实验试剂：

肾癌786—O细胞株，75%酒精，PBS溶液，胰酶，10％的胎牛血清RPMI1640培养液，33%的醋酸,结晶紫，甲醛，5%的脱脂奶粉,抗Rac和GAPDH抗体

2.2肾癌786—O细胞的培养实验

在无菌培养皿中迅速加入切除所得的肾癌周围的新鲜的组织样本，接种于培养瓶中，将培养瓶带入实验室放入37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳,95%饱和湿度的培养箱内。

打开超净工作台的紫外灯照射20分钟，关闭灯开关，打开仪器的排风系统，戴上消毒手套，使用在酒精灯上消过毒的镊子夹取使用百分之七十五的酒精溶液浸过的棉球反复擦拭操作台桌面。

从冰箱中取出培养液与培养瓶以及消毒滴管放入超净工作台开始操作。

将用酒精灯消毒过的培养瓶中的液体倒出，用巴氏吸管滴入PBS液并对培养瓶的底表面反复吹打清洗，吸取10ml液体，将其在1000转每分钟的离心机中离心5分钟，弃去上清液，在培养瓶中加入百分之零点二十五的胰酶对其消化约2分钟，在离心机1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液，将它悬于含有10％的胎牛血清RPMI1640培养液中，于37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。

隔24个小时在显微镜下对细胞生长情况进行观察和记录。

2.3肾癌786—O细胞的传代实验

如上所述，在消毒灭菌之后进行实验操作。

将PBS溶液，培养液等放进工作台中，取出铺满底部的肾癌786—O细胞，先在显微镜下观察它的生长状况，当786—O细胞形状由梭形转变成圆形以后，加入百分之十的100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素胎牛血清高糖RPMI1640培养液2ml终止消化，用巴氏吸管轻吹打培养瓶底部待细胞脱落后将细胞混悬液移入10ml离心管，放入离心机中在1500转每分钟下离心5min，丢掉上清溶液，加入PBS溶液漂洗一次，并将溶液重新悬浮于刚才配好的高糖RPMI1640含血清培养基中，于37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。

隔24个小时在显微镜下对细胞生长情况进行观察和记录。

两天传代一次，传代三次。

2.4肾癌786—O细胞的Transwell迁移实验

用五十毫克每升的人工基底膜基质经过1:

5倍的稀释得到的液体覆盖在Transwell小室底部膜的上表面，在室内温度下使其完全干燥。

在Transwell小试的小孔当中滴入吸取到的100μL的无血清高糖RPMI1640DMEM培养液，在三十七摄氏度下放置30分钟左右。

然后我们在上室的聚碳酸酯膜的上方加入已经稀释过的一微升中含有3.9微克的肾癌786—O细胞培养液30μL，在37℃下把它放置30min，以便于将人工基底膜基质聚合生成凝胶[10]。

使用0.25％的胰酶消化细胞消化约2分钟，停止消化后在1500转每分钟下离心弃去培养液，之后用PBS溶液清洗洗2次，用无血清培养基重悬，并将细胞密度调整到5×10^5每毫升，吸取100微升的细胞悬液到Trallwell迁移上室中，在24孔板下室中滴进HZ27溶液，分别为1.67μM低剂量药物，3.3μM中剂量药物，10μM高剂量药物，另设一组阴性对照组（不加药物，只加培养液，其他相同），常温常压下培养48个小时，用干净的棉签轻轻涂掉孔板中的上室内的细胞，加入含量体积分数为百分之四的多聚甲醛，以至于固定三十分钟后，使用百分之零点一的结晶紫溶液染色5分钟，用棉签将结晶紫擦拭，运用正置显微镜进行观察以及拍照并记录,然后使用33%的醋酸将结晶紫洗脱，分别测得洗脱液的OD值。

平行重复三次试验。

2.5免疫印迹法检测肾癌786—O细胞中蛋白Rac表达实验

将肾癌786—O细胞经过靶向中剂量药物转染四十八小时后，被RIPA裂解液中的蛋白酶抑制剂所裂解，从而将细胞中的蛋白质给提取出来。

蛋白质的浓度我们可以通过使用BCA蛋白检测试剂盒测定。

使用6％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行操作，以三十微克每孔的上样数量上样，把被电泳分离得到的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上面，用百分含量为五的脱脂奶粉的TBST隔绝空气室温下放置一小时，向其中加入稀释了一千倍的抗Rac和GAPDH抗体，之后分别滴加进稀释了一千倍的DyLight800对这两种物质进行荧光二抗标记[11]，在25摄氏度下反应约两小时。

进行洗膜操作并使用Odyssey红外荧光成像仪对图像进行扫描，最后分析结果时运用Photoshop软件[12]。

3结果与讨论

3.1Rac转染786—O细胞

Rac蛋白可以转染肾癌786—O细胞这在实验过程中是十分明显可以观察到的，如图一显示的图片，实验观察中我们在荧光显微镜下可以观察到转染的细胞呈现绿光，转染的概率非常高。

3.2细胞活性

从实验结果得到的照片中可知：

药物对Rac蛋白有所抑制后，它转染抑制了Rac蛋白也在同一时间控制了肾癌786—O细胞的生长和繁殖。

且药物剂量越高，对Rac蛋白的抑制力越强，对于细胞迁移抑制力越强。

3.3Transwell迁移试验

3.3.1细胞迁移定性分析

以下照片分别记录了使用1.67μM低剂量HZ27药物，3.3μM中剂量HZ27药物，10μM高剂量HZ27药物作用于细胞和阴性对照在Transwell小试下室中迁移得到的786—O细胞数目。

可知高剂量可有效抑制肾癌786—O细胞转移，随着HZ27药物剂量越高，肾癌786—O细胞的转移能力越弱。

阴性对照（Negativecontrolgroup）1.67μM低剂量（Lowdose1.67μM）

3.3μM中剂量（Thedose3.3μM）10μM高剂量（Highdose10μM）

图1：

不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移影响比较（×200）

Fig.1DifferentconcentrationofHZ27drugeffectsonkidneycancercellmigratin786-O（×200）

3.3.2细胞迁移定量分析

上述图片我们可以定性地观察到药物HZ27对肾癌786—O细胞迁移影响，下面我们通过对药物OD值的比较定性地比较不同浓度药物HZ27对肾癌786—O细胞迁移影响。

表1：

不同浓度的HZ27药物OD值的比较

Table1：

ThecomparisonofdifferentconcentrationsofHZ27drugODvalue

OD值

次数

剂量

阴性对照

低剂量1.67μM

中剂量3.3uμM

高剂量10μM

第一次

1.858

1.742

0.927

0.865

第二次

1.513

1.398

0.864

0.735

第三次

1.740

1.638

0.835

0.793

计算抑制率公式：

抑制率%=（1-剂量浓度OD值/阴性对照OD值）*100%

以第一次低剂量药物为例数据处理如下:

抑制率%=（1-1.742/1.858）*100%=6.24%

标准差计算公式：

S=√[（x1-x）^2+（x2-x）^2+......（xn-x）^2]/n

将每一步的计算结果记录下面的表格当中：

表2：

不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移的抑制率

Table1:

DifferentconcentrationsofHZ27drugsforkidneycancerinhibitionrateof786-Ocellmigration

抑制率

次数

剂量

低剂量1.67μM（%）

中剂量3.3μM（%）

高剂量10μM（%）

第一次

6.24

50.1

53.4

第二次

7.60

42.9

51.4

第三次

5.86

52.0

54.4

平均值

6.57

48.3

53.1

标准偏差

0.75

0.40

0.13

以上表格对于不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移的抑制率做了定量分析，从中我们可以从不同浓度抑制率的平均值中了解到随着药物剂量的不断增多，对肾癌786—O细胞迁移的抑制率不断变大，在1.67μM~3.3μM之间的HZ27药物浓度对肾癌786—O细胞迁移的抑制急剧增长，而在3.3μM到10μM之间的HZ27药物浓度对肾癌786—O细胞迁移的抑制增长缓慢。

用平均值计算其标准偏差可见在相同浓度下测得的抑制率有所不同，而在3.3μM下的抑制率偏差最大，可见药物对于细胞转移的控制并不是十分稳定。

下面对以上数据进行定性分析，绘制图表如下：

图2：

不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移的抑制率

Table2:

DifferentconcentrationsofHZ27drugsforkidneycancerinhibitionrateof786-Ocellmigration

图3：

不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移的抑制率

Table3:

DifferentconcentrationsofHZ27drugsforkidneycancerinhibitionrateof786-Ocellmigration

上述柱状图与折线图可以定性得表现出从1.67μM到3.3μM浓度的HZ27剂量对于肾癌786—O细胞转移抑制率的影响最大，中剂量药物浓度与高剂量药物浓相比度对细胞转移的抑制率差异不明显。

如要选用此种药物抑制肾癌786—O细胞转移，则可以选用中剂量。

3.4免疫印迹试验

表三：

3.3μM的HZ27药物对Rac蛋白表达的影响比较

Fig.4:

3.3μMHZ27drugsaffecttheRacproteinexpression

蛋白

免疫印迹

阴性对照组

中剂量组

Rac

GAPDH

本次试验的第一步是将SDS—PSGE蛋白样品Rac与GAPDH两种蛋白经过SDS处理后使得蛋白样品带有阴极电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极涌动，第二步是电泳的蛋白质Rac与GAPDH使用电转移转移到硝酸纤维固体膜上，第三步酶免疫定位将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜分别和特异性抗体和酶标第二抗体作用，加入显色底物使其染色。

由实验结果可以看出：

1、Rac蛋白在阴性对照组和中剂量组的免疫印迹明显比GAPDH蛋白淡；2、GAPDH的阴性对照组和中剂量组免疫印迹浓度差不多；3、Rac蛋白阴性对照组免疫印迹比中剂量组浓。

从上所述，对于实验结果分析如下：

第一种结果的原因是在细胞中蛋白样品GAPDH的表达强过Rac的表达；第二种结果发生的原因是HZ27药物不能抑制GAPDH蛋白的表达，所以其阴性对照组和中剂量组的实验结果相同；出现第三种结果的原因是HZ27药物可以作用于Rac蛋白，以抑制Rac蛋白的表达，使中剂量组的免疫印迹比阴性对照组淡。

4结论

（一）HZ27可以有效抑制Rac蛋白的表达，以抑制肾癌786—O细胞的迁移。

（二）中剂量3.3μM的HZ27适用于抑制肾癌786—O细胞的迁移。

参考文献：

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analysisofConnecticutTumorRegistrydata,1935-1989.IntJCancer,1994,58∶57-63.

[2]DecastroGJ,McKiernanJM.Epidemiology,clinicalstaging,andpresentationofrenalcellcarcinoma.UrolClinNorthAm,2008,35:

581-592.

[3]张永贞,杨国庆,张思维,郑荣寿,曹凌,陈万青.中国2009年肾及泌尿系统其他癌发病和死亡分析.山西省肿瘤医院.国家癌症中心.北京

[4]TavaniA,VechiaC.Epidemiologyofrenalcellcarcinoma.JNephrol,1997,10∶93-106.

[5]PrineasRJ,FolsomAR,ZhangZM,etal.Nutritionandotherriskfactorsforrenalcellcarcinomainpostmenopausalwomen.Epidemiology,1997,8∶31-36.

[6]ItohRE,KurokawaK,OhbaY,etal.ActivationofracandCdc42