DNA体外合成与序列测定_精品文档.ppt
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DNA的体外合成的体外合成A.DNA的化学合成的化学合成uDNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设计制造的。
2022/11/11南京农业大学生命科学学院石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院1.合成的原理合成的原理u核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
u每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
u合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.DNA的化学合成的化学合成1.合成的原理合成的原理核酸固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3-OH与固相载体成共价键，5-OH被4，4-二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护，下一个核苷酸的5-OH亦被DMTr保护，3-OH上的磷酸基上有-N（C3H7）2和-OCH3两个基团。
2022/11/13石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院2022/11/1南京农业大学生命科学学院4每延伸一个核苷酸需四步化学反应：
（1）脱三苯甲基：
末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH。
（2）缩合：
新生成的5-OH在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。
（3）盖帽：
有少量（小于0.5%）未缩合的5-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
（4）氧化：
新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.DNA的化学合成的化学合成2.合成后处理合成后处理u合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。
n切切割割：
合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。
切割后的寡核苷酸具有游离的3-OH。
n脱脱保保护护：
切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。
磷酸基的保护基-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55放置15h左右方能脱掉。
n纯纯化化：
纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。
通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。
纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。
n近近年年来来发发展展了了一一些些修修饰饰试试剂剂，可可在在合合成成寡寡核核苷苷酸酸时时，对对某某些些核核苷苷酸酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。
进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。
2022/11/15石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院第二节第二节DNA的体外合成的体外合成B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）u聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。
此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。
uPCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。
uMullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。
2022/11/16南京农业大学生命科学学院石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）uPCR的原理：
u原理类似于DNA的天然复制过程。
即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。
PCR包括三个基本过程：
n变性变性。
加热模板使其解离成单链。
n退退火火。
降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。
n延延伸伸。
在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。
这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过3035个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106107倍。
2022/11/17石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院2022/11/1南京农业大学生命科学学院8石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定uDNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。
RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。
u在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。
u目前应用最广泛的是：
nSanger双脱氧链终止法。
nMaxam-GilbertDNA化学降解法。
n新技术：
杂交测序法，质谱法，单分子测序法，原子探针显微镜测序法，DNA芯片法。
2022/11/1南京农业大学生命科学学院9石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法60年年代代末末就就已已掌掌握握了了充充分分的的理理论论知知识识，只只是是当当时时在在某某些些技技术术能能力力上上和和研研究究思思路路上上，存存在在着着弱弱点点，阻阻碍碍了了从从理理论论转转变变为为现现实实。
第第一一，如如何何分分离离寡寡核核苷苷酸酸片片段段；另另一一方方面面，在在研研究究思思路路上上都都没没有有摆摆脱脱蛋蛋白白质质序序列列分分析析的的束束缚缚。
1965，Cornall大大学学以以SWHolle，为为首首的的科科学学家家小小组组，首首次次完完成成75个个核核苷苷酸酸的的酵酵母母丙丙氨氨酸酸tRNA的的全全序序列列测测定定。
即即利利用用各各种种RNA酶酶把把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：
1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。
有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本原理基本原理：
u在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双双脱脱氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷（ddNTP），由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。
u由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。
2022/11/1南京农业大学生命科学学院12石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院q反反应应：
同时加入引引物物和和模模板板、DNA聚聚合合酶酶1、一一种种ddNTP、以以及及四四种种dNTP（有一种带放射性标记）。
q变变性性胶胶电电泳泳分离反应混合物。
q放放射射自自显显影影术术，检测单链DNA片段的放射性带。
q结结果果判判读读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。
考考你：
考考你：
反应混合物中，标记什么最方便？
反应混合物中，标记什么最方便？
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本原理基本原理：
u测序所用的测序所用的ddNTPuddNTPs是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。
反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1：
34）。
2022/11/1南京农业大学生命科学学院14v在在自自动动测测序序中中将将荧荧光光素连在素连在4种种ddNTP上上石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本步骤基本步骤：
n测序模板的纯化与定量n测序反应PCR仪n测序反应产物纯化与变性n上样电泳测序仪n分析结果2022/11/1南京农业大学生命科学学院15石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院2022/11/116南京农业大学生命科学学院石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院2022/11/117南京农业大学生命科学学院毛细管电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u测序结果：
2022/11/1南京农业大学生命科学学院18石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院uDNA测序仪的多种应用：
测序仪的多种应用：
2022/11/1南京农业大学生命科学学院19石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧双脱氧-M13体系体系DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分分析析：
这这样样处处理理后后，能能策策得得高高分分子子量量DNA吗吗？
为为了了将将这这些些降降解解的的DNA片片段段，按按其其原原来来的的顺顺序序“拼拼排排”起起来来，至至少少还还需需要要用用一一种种或或数数种种其其它它内内切切限限制制酶酶，对同种对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
实际上可行吗？
实际上可行吗？
高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。
片段，供进一步分析。
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院这这些些供供作作序序列列测测定定的的DNA片片段段绝绝大大多多数数都都仅仅为为数数百百个个核核酸酸。
因因此此需需要要用用物物理理方方法法分分离离大大量量的的DNA片片段段。
费费时时费费钱钱，因因为为商商品品提提供供的的核核酸酸内内切切限限制制酶酶的的价价格格是是十十分分昂昂贵贵。
为为了了保保证证能能够够获获得得所所有有的的限限制制片片段段，就就需需要要制制备备足足多多数数量量的的DNA，而而其其中中有有许许多多步步骤骤都都要要用用不不同同浓浓度度的的凝凝胶胶进进行行电电泳泳再再纯纯化。
在这种纯化过程中，会加剧化。
在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。
的损伤和丢失。
石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院克服缺点的一种途径克服缺点的一种途径DNA分子克隆分子克隆将将不不同同限限制制酶酶消消化化切切割割的的DNA限限制制片片段段，随随机机地地克克隆隆到到载载体体分分子子上上。
选选用用天天然然的的单单链链DNA噬噬菌菌体体，例例如如M13作作为为载载体，重组体噬菌体的体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
分子，可直接用作模板。
引引物物：
合合成成的的特特定定的的寡寡核核苷苷酸酸，或或者者是是从从亲亲本本单单链链噬噬菌菌体体DNA中中分分离离出出来来的的一一种种限限制制片片段段。
其其特特点点是是能能够够特特异异性性地地同同载载体体分分子子上上与与克克隆隆位位点点相相连连的的单单链链DNA区区段段杂杂交交。
称称做做“通通用用引引物物”。
石河
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