生化工程2-菌株的分离_精品文档.ppt

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菌株的富集与分离工业菌种的分离原则nn1.根据发酵条件来筛选适应菌种。

nn2.菌的生长温度应尽量高。

nn3.菌对环境和设备的适应性和稳定性。

nn4.菌种的生产效率和毒性，副产物等。

菌种的筛选与分离菌种的筛选与分离nn施加选择压力

（1）控制培养基成分

（2）控制培养条件（3）抑制不需要的菌类利用菌种的生理活性特点根据目的菌株及其产物特点分根据目的菌株及其产物特点分选择性分离方法选择性分离方法随机分离方法随机分离方法（定向筛选定向筛选选择压力选择压力）（用筛选方案用筛选方案-检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养固体培养基条件培养固体培养基条件培养（初筛初筛）菌种纯化菌种纯化复筛复筛菌种纯化菌种纯化初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索再复筛再复筛生产性能测试生产性能测试较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验某些必要试验和某些必要试验和或作为育种的出发菌株或作为育种的出发菌株毒性试验等毒性试验等n菌种的纯种分离菌种的纯种分离n

（1）划线法：

简单、快捷。

）划线法：

简单、快捷。

n

（2）稀释法：

菌落单一均匀。

）稀释法：

菌落单一均匀。

固体培养基划线接种法稀释涂抹接种法稀释涂抹接种法生产性能的测定生产性能的测定n一般采用两步法：

一般采用两步法：

n初筛：

以量为主初筛：

以量为主n复筛：

以质为主复筛：

以质为主菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势nn野生菌野生菌变异菌变异菌nn自然选育自然选育代谢控制育种代谢控制育种nn诱发基因突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种菌株的选育菌株的选育菌种选育的理论基础菌种选育的理论基础nn微生物遗传的相对稳定和变异性。

由于变异的存在，使获得新性状的菌种成为可能nn遗传变异的根本原因是基因的改变：

基因突变和基因重组菌种选育的方法菌种选育的方法nn菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程这四种方法。

自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种。

杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种。

菌种选育的方法菌种选育的方法nn自然选育自然选育nn概念：

利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，获得优良菌株的纯种选育的方法。

nn可以纯化、复壮菌种，这是因为菌种在自发突变过程中，多数发生负向变异。

nn为什么菌种多数倾向于发生负向变异？

菌种退化和变异的原因菌种退化和变异的原因nn总的来说：

内因外因总的来说：

内因外因1.1.遗传基因型的分离遗传基因型的分离要点：

遗传物质的多样化，群体繁殖要点：

遗传物质的多样化，群体繁殖2.2.自发突变原因：

自发突变原因：

11）沙土管长期保藏）沙土管长期保藏2）2）连续传代连续传代33）新陈代谢产生的诱变物质）新陈代谢产生的诱变物质44）增变基因、死亡基因的存在）增变基因、死亡基因的存在3.3.经诱变剂处理后的退化变异经诱变剂处理后的退化变异进一步选育或保藏进一步选育或保藏移种生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子斜面种子（初筛初筛）高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产试验生产试验nn优点：

简单易行nn缺点：

效率低、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。

诱变育种：

诱变育种：

诱变育种是一种纯种选育方法。

以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株的过程。

nn物理诱变nn化学诱变nn生物诱变nn物理诱变：

包括各种射线照射，超声波，激光照射，离子流，失重等等物理因素的造成的菌种遗传物质的突变nn化学诱变剂化学诱变剂nn能和DNA相互作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。

nn主要有碱基类似物、吖啶类、烷化剂特点：

高效、经济、但多数是强致癌物但多数是强致癌物，应注意安全。

nn生物诱变剂nn噬菌体可用于抗噬菌体菌种的选育，其原理可能与诱发抗性突变有关菌种诱变育种的步骤菌种诱变育种的步骤诱变育种步骤诱变育种步骤ll出发菌株的选择出发菌株的选择ll处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备ll诱变处理诱变处理ll中间培养中间培养ll分离和筛选分离和筛选nn出发菌株的选择出发菌株的选择nn1.1.选择纯种选择纯种nn2.2.平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不大，平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不大，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。

摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。

nn3.3.有良好的代谢特性有良好的代谢特性nn4.4.选择对诱变剂敏感的菌株。

选择对诱变剂敏感的菌株。

nn5.5.选用多个出发菌株进行诱变收效较快选用多个出发菌株进行诱变收效较快。

处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备nn为什么要将菌株制成菌悬液来进行诱变？

nn诱变处理诱变处理nn诱变剂的选择诱变剂的选择野生型菌株（遗传性不稳定）:

用缓和的诱变剂。

遗传性稳定的菌株:

先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。

要考虑诱变剂的作用机理和菌株的遗传背景、生理状态等来选择诱变剂，多种诱变剂复合使用效果好。

最适剂量：

一般杀菌率90%99%较好，甚至99.9%，也有低至40-60%的nn突变菌株的筛选突变菌株的筛选：

直接摇瓶筛选法直接摇瓶筛选法工作量大，效率低工作量大，效率低琼脂块筛选法琼脂块筛选法简单、快速，但不准确简单、快速，但不准确半理性化筛选半理性化筛选自动化筛选（筛选几千个菌落数自动化筛选（筛选几千个菌落数/天）天）nn理性化筛选（rationalscreening）是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以获得能大量形成发酵产物的高产突变株。

影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素nn出发菌株的遗传特性出发菌株的遗传特性nn诱变剂诱变剂nn菌种的生理状态菌种的生理状态nn被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件诱变处理时的外界条件例如碱基类似物、亚硝基胍等只对分裂中的例如碱基类似物、亚硝基胍等只对分裂中的DNADNA有效，有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而如紫外线、亚对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNADNA起反应，因起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。

因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌更有效。

因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。

发可以提高诱变率。

nn诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。

可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。

例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。

紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。

诱变育种的一些问题诱变育种的一些问题nn诱变手段的复合化与多样化nn诱变强度的控制nn正向突变与反向突变nn变异菌株的筛选现代菌种选育技术现代菌种选育技术nn杂交育种nn原生质体融合技术nn基因工程技术杂交育种杂交育种理论基础基因重组将两个将两个不同性状不同性状个体内的遗传基因个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传转移到一起，经过遗传分子间分子间的重新组的重新组合，形成合，形成新遗传型新遗传型个体的方式，称为基个体的方式，称为基因重组（因重组（generecombinationgenerecombination）。

）。

基因重基因重组甲甲甲甲生长快、产量低生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高重组与杂交的关系：

重组：

分子水平，一般在体外重组：

分子水平，一般在体外重组：

分子水平，一般在体外重组：

分子水平，一般在体外杂交（杂交（杂交（杂交（hybridizationhybridizationhybridizationhybridization）：

细胞水平）：

细胞水平）：

细胞水平）：

细胞水平杂交中必然包含着重组；重组则不限于杂交这一形式。

接合：

接合：

接合：

接合：

细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。

能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒一、常规的杂交育种一、常规的杂交育种nn

（一）遗传标记杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。

如营养缺陷型、抗药性突变型等等，遗传标记的方法通常是将两个用来杂交的野生型菌株，经过诱变得到两株不同的遗传特性菌株作为杂交的直接亲本菌株。

nn

（二）异核体形成获得异核体有许多种方法，例如完全培养基混合培养法。

将两个直接亲本（营养缺陷型）的孢子混合接种于液体完全培养基完全培养基中，培养l2天，挑出生长的菌丝体，将菌丝取出，撕碎，置于基本培养基基本培养基平板上培养七天，由菌丝碎片长出的菌丝即为异核体。

异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的，即在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里，能够互补营养，因此能在基本培养基上生长。

nn（三）杂合二倍体的形成杂合二倍体形成的方法是在基本培养基平板上分离异核体所产生的分生孢子，异核体的分生孢子里偶尔有两个遗传性状不同的细胞核发生了融合，这样就形成了杂合二倍核。

这个杂合二倍核经过繁殖，就可以得到杂合二倍体。

异核体自发形成杂合二倍体的频率较低，因此必须人为地提高形成杂合二倍体的频率。

常用的方法有：

提高异核体的培养温度，用紫外线照射异核体，用樟脑蒸气熏异核体菌丝等。

nnnn（四）染色体交换和单倍体化杂合二倍体一般是稳定的，但也有极少数杂合二倍体的细胞核在无性繁殖的细胞分裂过程中偶然发生染色体交换和单倍体化，产生很多类型的二倍体或单倍体分离子。

用诱变剂处理则使得分离子的类型更多，这些分离子从表型上可以分为亲本型分离子和重组型分离子两种。

杂交育种的优点：

由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。

均比诱变育种前进了一大步。

利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。

此，它是一种重要的育种手段。

原生质体融合育种原生质体融合育种nn原生质体融合育种原生质体融合育种原生质体：

植物或微生物细胞原生质体：

植物或微生物细胞去掉壁去掉壁以后的以后的内含物称原生质体内含物称原生质体原生质体融合育种是基因重组育种的一种重要方法原生质体融合育种是基因重组育种的一种重要方法ll原生质体融合育种步骤原生质体融合育种步骤ll标记菌株的筛选和稳定性验证。

标记菌株的筛选和稳定性验证。

ll原生质体制备。

原生质体制备。

ll等量原生质体加聚乙二醇促进融合。

等量原生质体加聚乙二醇促进融合。

ll涂布于再生培养基，再生出菌落。

涂布于再生培养基，再生出菌落。

ll选选择择性性培培养养基基上上划划线线生生长长，分分离离验验证证，挑挑取取融融合合子进一步试验、保藏。

子进一步试验、保藏。

ll生产性能筛选。

生产性能筛选。

原生质体融合育种的关键标记菌种的选择标记菌种的选择获获得得标标记记菌菌种种的的方方法法是是采采用用常常规