病理技术员培训.docx

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病理技术员培训

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概述

v病理学是研究疾病的病因、发生机制、病理变化、结局和转归的一门学科。

v病理学是一门基础学科，但又是联系基础医学和临床医学的桥梁。

包括病理解剖学和病理生理学。

v病理学常用研究方法：

1.尸体解剖2.活体组织学检查3.脱落细胞学检查4.动物实验

5.组织和细胞培养

1.尸体解剖：

遗体→病理解剖、观察→正确诊断、查明死因、解释临床症状和体征等临床现象及时发现和确诊新疾病，特别是传染病提供第一手科研材料

2.活体组织学检查：

局部手术、嵌取、穿刺针吸→肉眼和镜下病理观察→良恶性肿瘤诊断和疑难病例确诊

乳腺癌：

对乳房肿块诊断不清，怀疑非实质病变者可采取穿刺针吸小块组织做病理检查，方法简单诊断可靠率高，尤其对鉴别诊断有重要价值。

如通过各种方法均未取得结果而仍诊断不清，直接切取活体组织检查。

前列腺癌：

直肠指诊DRE，在前列腺癌的筛选检查中必不可少且简单、经济、方便和穿刺活检以早期发现前列腺癌。

前列腺癌的确诊必须通过病理活检证实,经直肠超声引导下前列腺穿刺活检术操作简单、准确性高、安全、并发症少。

胃癌：

3.脱落细胞学检查：

肿瘤的普查和早期发现、早治疗

（1）宫颈癌：

阴道脱落细胞检查为早期最有效的检查

（2）乳腺癌：

乳头溢液者，可收集液体涂片送病理查找癌细胞。

（3）肺癌：

反复痰中查癌细胞，获阳性结果，有确诊价值

（4）食道癌：

食管拉网细胞学，初筛，承受度和敏感性较低，约束了其广泛使用

（5）膀胱癌：

尿脱落细胞检查：

是一种简单易行又无创伤的膀胱癌检查方法，对膀胱癌的诊断有重要价值，膀胱癌病人约85%尿脱落细胞检查可呈阳性。

•5.动物实验:

•6.组织和细胞培养：

第一节标本制作的常规工作

•1.清洁工作：

工作实验室要干净整洁，固体废弃物要存放于医用垃圾袋内，防止污染，保持水管通畅。

•2.接受标本工作：

核对检查申请单、送检标本及标志，对于送检的微小标本必须认真核对容器内或滤纸上是否有组织及数量，容器无名字的应立即写上名字；检查标本固定液是否充足，按顺序存放。

•3.标本登记工作：

将检查后的标本登记在登记卡，包括验收日期和病理编号，编号写在申请送检单右上角，按顺序排放，为取材做准备。

•4.标本取材工作：

先核对再取材，取材后在按编号放置，脱水盒背面详细记录取材情况，并写上日期和签上取材人姓名。

第一节标本制作的常规工作

•5.取材后标本进行固定、脱水、包埋、切片、染色。

•6、染色后贴标签送诊断室观察，诊断发出后及时登记诊断结果，切片蜡块及时归档。

•7.存放溶液试剂及染料的容器必须及时贴标签，注明名称和配制日期。

•8.配制强酸试剂、挥发易燃试剂注意安全。

•9.室内不用的电器、灯火须及时关闭。

•10.染色液、脱水液如有沉渣，应过滤后备用。

第二章组织切片程序

• 冰冻切片   石蜡切片   火棉胶切片

      ︳          ↓          ︳

——————————→先取材←——————————

↓

再固定

↓

冰冻←———————— --- ----冲水

∣          ↓

∣          脱水———————————

∣          ↓          ↓

∣          透明        乙醚酒精

∣          ↓          ↓

∣          浸蜡        胶液渗透      

∣          ↓          ↓

∣          石蜡包埋    火棉胶包埋    

↓          ↓          ↓

冰冻切片  切片        切片  

↓          ↓          ↓

染色     染色        染色  

↓          ↓          ↓

封固      封固        封固  

一、标本取材

•切取病变组织或拟研究的组织

•应选择病变或可疑病变的组织。

必要时选取病变与正常组织交界处。

•切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm2为佳，厚度以3—5mm为度，过大过厚会影响对标本的固定，另方面也影响切片的制作。

病理科标本检查和取材制度

•1、标本的检查和取材由病理医师承担。

•2、病理医师通过肉眼仔细观察标本，判断病变的部位、大小、浸润深度及与切缘和周围组织的关系，然后挑选有代表性的部位取材，做病理切片。

取材必须遵从规范要求，以保证诊断的准确性，提供准确的TNM分期信息和其他与治疗、估计预后相关的信息。

•3、取材前应核对申请单编号与标本的编号、标本的份数是否相符，申请单与标本应有双标记和双核对，并仔细阅读申请单中的内容，初步判断病变的性质，做到对病变心中有数。

•4、标本检查和取材应按照有关的操作规范进行；应当对大体标本进行细致的观察，并有相应的文字记录。

•5、取材结束后必须核对组织块，并在取材记录单上标示；随后将记录单交病理技术人员，供切片染色后核对使用。

•6、组织块应该每块分别编号，并做到一一对应。

•7、取材后剩余的标本应妥善保存，保存至病理报告发出后2周时间。

•8、剩余的病理标本和标本容器属于医疗废弃物，应按照“医疗废物”的规定处理，不可随意丢弃。

•9、科室质量与安全管理小组定期对取材质量进行自查，及时总结和发现问题，制定措施，持续改进取材质量。

标本取材原则：

•1.应详细描述标本的数量、大小（mm、cm、多量时聚堆测量）、形状、色泽、和质地等

•2.小量小标本，应全部取材

•3.多量小标本，取材后剩余者应保管好备用

•4.粘膜和皮肤应“立埋”以便观察各层结构

大标本取材：

•记录标本的手术类型

•描述和记录标本大小（三维长度、形状、色泽、表面、质地等）球形标本可测直径

•切面：

沿大面切开，描述和记录其特点，如实性或囊性，各占比例，色泽、质地、出血坏死，囊壁厚度，内容物颜色等

•前列腺、甲状腺、胰腺等脏器应间隔一定距离做多个平行破面，以免漏掉微小肿瘤.

•取代表性区域，并与正常组织交界处取材

•完整瘤体要带包膜，如甲状腺、乳腺

•取材块的大小2cmx1.5cmx0.3cm

•编号：

数量、剩余组织记录“留”，全部取材时记录（全包）一包等，微小组织试做

•重取材要记录

活体小组织（小标本）取材：

组织标本体积小,在取材时应特别小心,用伊红让标本着色,并用插镜纸包裹,以防丢失,应标明粒数.多瓶组织应将附号标清楚.

标本的来源与收集

（一）

1、临床活检

2、尸体解剖

3、实验动物

（二）

1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相符合。

2、标本是否符合要求。

取材注意事项

1.及时、尽可能新鲜

2.迅速固定、冷藏

3.刀要快，不要挤压组织

4.注意研究目的

培养

定量

对比观察

临床诊断

临床病理取材注意事项

1、检查申请单的姓名是否与标本标注的姓名相符

2、检查申请单所列标本是否与实际标本吻合。

3、检查申请单所列标本件数是否与实际标本件数吻合。

二组织固定

概念：

用化学试剂保持尸体、器官、组织和细胞固有形态

结构的过程谓固定

所用的化学试剂谓固定剂或固定液。

目的：

防止自溶、腐败，保持良好结构

原理：

使组织及细胞内蛋白凝固；

使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质

方法：

浸泡

灌注：

局部灌注、全身灌注

蒸汽熏蒸

固定的作用

固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性酶和内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，不但使抗原不致失活，还要使抗原不发生弥散，以免在免疫组化染色时产生过深的背景。

固定的目的

1、能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶

2、能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等

3、使组织硬化，便于切块

4、对某些具有传染性的标本，能防止其扩散

5、保存组织细胞中固有的物质

6、保存好大体标本

7、可增强染色

固定时间:

常规组织病理学:

可长时间固定

细胞病理学：

可长时间固定

细胞化学：

不宜过长，约1小时为宜

固定后处理：

充分洗涤

固定时间越长，洗涤时间也应相应增加

固定的注意事项

①一般应在离体30分钟内固定,越及时越好,并将组织上的血液,分泌物冲洗干净

②固定剂的量一般不少于组织块总体积的4倍以上，一般为10--15倍，容器勿过小。

③固定的时间应视组织的种类和大小决定,一般小组织4-6小时,大组织18-24小时或更长。

④有特殊要求的须用特殊的固定剂;超微结构观察：

低温固定

⑤不同组织在固定时应注意特殊的处理方法

⑤不同组织在固定时应注意特殊的处理方法

•为防止组织因固定剂作用而发生变形，对软薄组织如神经、肌腱、肠系膜等应先平摊鱼吸水纸上，在投入固定剂中，可防止蛋白质凝固而引起的扭曲变形；

•对含气体而浮于液体表面的组织如肺，可连以重物使其下沉，或在组织上覆盖脱脂棉，以防止组织表面干燥。

固定液的选择

1、尽量选择对组织收缩少，渗透快的固定液

2、选择较通用的固定液，既能做好HE的染色，又能做免疫组化标记

3、特殊的病例选择特殊的固定液

如：

狂犬病——丙酮

磷酸酶——丙酮

糖原——无水酒精

•。

固定液的分类

Ⅰ.醛类：

甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等

Ⅱ.氧化剂类：

四氧化饿（奥酸）、高锰酸钾、重鉻酸钾等

Ⅲ.蛋白变性类：

醋酸、甲醇、乙醇等

Ⅳ.其它：

氯化汞，苦味酸等。

固定液

甲醛溶液：

福尔马林，Formeldehyde

4％甲醛，或10％福尔马林

40％甲醛

用于无特要求的组织常规固定

乙醇（EthylAlcohol）:

95%

用于细胞涂片常规固定，糖原固定

乙醇乙醚混合固定液:

95%：

95%乙醇+95%乙醚（1:

1）

用于细胞涂片巴氏染色

固定液的使用

（一）甲醛（formaldehyde）

一般市售的含37-40%，平时使用都把它看为100%。

它由甲醛气体饱和于水而成。

比重为1.12，有一股刺鼻的气味。

甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合。

如近来的抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后，要将它们显示出来，就必须应用温度高达92℃以上的抗原修复液，才能将其交联的醛键打开，与后来的抗体结合，将其表达出来。

甲醛的优点：

1、收缩较小

2、固定较为均匀，穿透力强

3、能使组织硬化并富有弹性

4、能保存脂肪及脂类物质

5、成本较低

甲醛的缺点：

1、成分不纯，含少量的甲醇，影响酶反应

2、含少量的甲酸，易产生色素

3、不能固定尿酸和糖类物质

4、易挥发、污染环境

5、易产生醛基、封闭抗原

应用甲醛配成的固定液有：

1、缓冲福尔马林固定液（neutralbufferedformaaldehyde）

NaH2PO4·H2O　　4g

Na2HPO4（无水）　　65g

蒸馏水900ml

甲醛100ml

2、10%福尔马林固定液

甲醛10ml

自来水90ml

3、10%福尔马林盐固定液

甲醛10ml

自来水90ml

NaCl　　0.9g

4、Bouin氏固定液

苦味酸饱和水溶液75ml

甲醛25ml

冰醋酸5ml

5、Zonker氏液

氯化汞5g

重铬酸钾2.5g

硫酸钠1g

水100ml

注：

该固定液固定时间为16-24h，染色前应用碘酒除去汞盐的沉淀，否则会影响染色后切片的观察。

（二）酒精（alcohol）

有无水酒精（99.8%）和工业酒精（95%）在病理技术方面，酒精是一种重要的试剂，它可配成不同的浓度来进行脱水，如：

60%、70%、80%、90%、95%等，在切片染色前，用酒精来除去二甲苯，在染完色后则用其来脱水。

应当注意的是，组织脱水时应根据组织的大小、器官或部位、取材的大小来确定脱水时间，一般认为浓度越低，脱水时间可以相对延长，如70%可用来长期保存标本，但如果在100%的酒精里时间就不能太长，否则组织易脆不利于切片。

酒精可以与其它试剂混合，配成混合固定液，如AAF固定液。

酒精的优点：

1、可以保存糖原和尿酸结晶。

2、能在任何比例的情况下与水混合。

3、能溶解苯类物质，为染色法中的桥梁试剂。

4、能脱去切片上的水份。

5、可配成混合固定液。

6、可作为保存标本的固定液。

7、可用来消毒。

洒精的缺点：

1、可溶解脂类及脂肪物质。

2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。

3、渗透力不强。

4、可脱去某些已着染切片的颜色。

5、不作为单独的固定液。

6、价格昂贵。

三、石蜡包埋制样

组织块脱水：

逐级乙醇脱水

透明：

二甲苯

浸蜡：

65°C

包埋：

溶解蜡

（一）脱水

•脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂石蜡的渗入，这一过程称为脱水。

•脱水剂：

乙醇

•一般情况下,应将大小标本分别脱水.标本脱水从低浓度开始,一般人标本从70%或75%乙醇,动物标本从50%乙醇开始。

脱水后组织收缩、变脆。

人工脱水程序

（适应于3mm厚的组织块）

1、30%酒精24h2、50%酒精24h3、70%酒精24h

4、80%酒精24h5、90%酒精12h6、95%酒精4h7、95%酒精4h

细小组织脱水程序

（适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的组织）

1、80%酒精10-15min

2、90%酒精10-15min

3、95%酒精10-15min

4、100%酒精10-15min

5、二甲苯5-10min

6、石蜡15-20min

1、人工脱水法优点：

（1）可根椐不同的组织选择最佳时间。

（2）可避免细小的组织经受不必要的脱水时间,防止组织的硬脆．

（３）可灵活掌握，随时进行观察和调整．

2、人工脱水法的不是之处：

（1）需耗人力；

（2）必须在白天完成，晚上无法进行换液；

（3）如机器发生故障，组织块被搁置在外边，致使组织干涸，影响了制片的质量。

Shandan全封闭电脑控制全自动组织脱水机

该机由电脑、反应缸和试剂储存缸三部分构成。

电脑屏幕可显示时间、温度、所需时间、是否用真空负压等，可根据不同的时间要求，编制9套不同的组织脱水程序。

1、正常室温脱水程序

A、10%福尔马林2h

B、90%酒精1.5h

C、95%酒精1.5h

D、95%酒精1h

E、95%酒精1h

F、100%酒精1h

2、加温脱水程序

应用正常室温的脱水时间，再编入加温程序，加温的温度一般在37-40℃

3、真空负压脱水程序

应用正常室温的脱水时间，再编入真空负压脱水程序

4、周末程序

A、10%福尔马林10h

B、90%酒精10h

C、95%酒精10h

D、95%酒精10h

E、95%酒精10h

F、100%酒精2h

G、100%酒精2h

H、100%酒精2h

I、二甲苯1h

J、二甲苯1h

K、石蜡65℃真空负压1h

L、石蜡65℃真空负压1h

该机的特点：

1、容量大，一次可处理250-300个包埋盒。

2、全部密闭，试剂不易挥发，保护了环境。

3、带有定期的搅动装置，使组织固定均匀，脱水彻底，浸蜡充分。

4、脱水过程可使用真空负压和加热。

5、该机占地量小。

脱水方法及注意事项:

1.常用试剂为乙醇。

2.快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂，尸体解剖标本一般在无水乙醇后加丙酮。

3.因为脱水剂的新旧影响脱水时间,必须灵活掌握,根据本实验室情况,定时更换脱水剂.

•可用作固定液,也是一种比较好的脱水剂。

脱水能力强、速度快,可配制不同浓度进行脱水。

但一般情况下,多用在无水酒精的补充脱水。

•丙酮脱水性比酒精强,但容易使组织过度硬化,所以应适当掌握脱水时间。

（二）脱钙

•骨和其他钙化组织制片时应先脱钙再切片。

将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。

•常用脱钙剂是5%---10%硝酸溶液。

硝酸 5－10ml和蒸馏水 加至 100ml。

作用迅速，对组织不膨胀，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。

•脱钙时间视组织大小和含钙多少而定，以大头针可轻松刺入为准。

1．取材：

骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯

取厚度约0.5厘米骨片。

2．固定：

再以10%福尔马林固定2天。

3．将组织置于脱钙剂5%---10%硝酸溶液中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。

4．流水冲洗24小时（除酸）。

5．进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。

（三）透明

•透明的目的:

因为大多数脱水剂不能和石蜡相混合,组织内的水份脱干净后,必须通过透明剂的作用,才能便于浸蜡包埋.

↓

↓

既能溶于乙醇又能溶于石蜡

↓

因在此过程中，组织中的乙醇被透明剂取代，使其折光率接近组织蛋白的折光率，组织呈不同程度的透明状光线可以透过，故称透明。

常用透明剂种类及注意事项:

1.二甲苯是最为常用的一种透明剂，还有很多种，如三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯酚，松节油等。

2.透明要注意的关键是时间：

透明时间不够，石蜡不能完全进入组织，影响到包埋切片；但是如果透明过度，组织发硬发脆影响切片质，

故组织在二甲苯中不能久留.特别是肝脾等组织.

3.制片过程有两次透明：

第一次组织脱水后透明；

第二次切片染色透明。

（四）浸蜡

1.组织经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程，称浸蜡。

2.组织经过透明后要浸入石蜡内,目的是去除组织中的透明剂（二甲苯）而代之以石蜡,并渗入组织内部,把软组织变为有适当的硬度的蜡块以便切片.

3.一般浸蜡须经过2到3次,石蜡的溶点为54-60度左右,目前常用的脱水机上是两个蜡缸.浸蜡时要注意掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间

浸蜡作用

1、可起到填充、支撑的作用。

组织经酒精、二甲苯的作用后，其中有许多物质被溶解去，如脂肪及脂类物质、糖原等。

因而遗留下许多腔隙，妨碍了切片。

在切片时由于诱导剂的作用下石蜡可以浸入到物质的各个角落，当石蜡冷却时，浸入到各处的石蜡就填充在各处的空隙，包括血管和器官等。

使组织保持原有的形状，也使包埋后蜡块保持平整，便于切片。

2、使切片能完整的切除并保持切片的美观

浸蜡的方法

①传统浸蜡法

将透明好的组织放入熔化的石蜡中浸渍一定的时间。

②真空负压浸蜡法

将透明好的组织放入浸蜡缸中，然后移入真空负压箱内，或者脱水机自身配有的真空负压装置进行浸蜡。

浸蜡时间，真空负压数见表。

注意

•为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。

以熔点较低（54度以下）的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高（60-62度）的石蜡作为第二步，第三步。

浸蜡时间1－4小时，或更长，并使之过夜则较易切割。

但过长会使组织脆硬，切片时易破碎，过短，浸蜡不够，难以制成高质量切片。

（五）包埋

•包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。

•包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。

包埋时的注意事项：

1、所使用的镊子，包埋框，最好放于37的恒温箱内，以免这些物质过冷（在冬天时）而过早冷却包埋的石蜡，影响包埋的质量，这种现象在没有石蜡包埋机的单位较为明显。

2、打开脱水盒，取出组织块，将一平整的大的一面朝下，并用镊子压平，使其保持在一水平面上。

3、每包埋完一块，应附上标签，以免出差错或张冠李戴。

如为塑料包埋盒，则可少去这一步，极为方便。

4、对于管腔的组织如血管、肠、气管等应竖起来包埋对于皮肤及胃、肠、等组织应辩认好方向。

仔细包埋。

5、细小多块的组织，可包埋在一个蜡块，但应保持在同一平面上，以免影响切片。

6、包埋完后，蜡面凝固，便可放入水中加速硬化，如带有冷冻设备的包埋机，则可少去这一步。

7、包埋时组织块不能使其冷却凝固，应保持组织块上的蜡处于熔化状态，这样包埋时才能和包埋蜡溶为一体。

如果组织块自身的蜡先凝固，包埋后的蜡块切片时组织与边蜡分离切不成佳片严重的会崩掉，影响切片。

修切蜡块

应用包埋框包埋的组织块，切片前一定要将其切好，组织块与边蜡应保持有0.5cm的厚度，才有利于切片。

1、有利于切片，使切片能连续切出。

2、减少损伤刀口延长刀口的寿命，以利多切蜡块。

3、有利于切片的裱贴。

例如一张载片要裱两块组织时，修切好的蜡块，就能使它们摆得整齐。

•1.  组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时

后再换以新鲜福尔马林固定数小时。

2.  组织流水冲洗6－12小时。

3.  70％酒精2－4小时。

4.  85％酒精2－4小时。

5.  95％酒精（Ⅰ）2－4小时。

6.  95％酒精（Ⅱ）2－4小时。

7.  100％酒精（Ⅰ）2－4小时。

8.  100％酒精（Ⅱ）2小时。

9.  二甲苯（Ⅰ）0.5－1小时。

10.  二甲苯（Ⅱ）0.5小时。

11.  浸蜡（Ⅰ）2小时。

12.  浸蜡（Ⅱ）2小时。

13.  组织包埋。

•快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段，主要用于手术中决定手术的切除范围和手术方式。

快速切片的方法包括冰冻切片和快速石蜡切片。

•制作快速石蜡切片时，切取组织应该薄小，从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加温，一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪中预热，恒温下操作，整个过程大约在10－15分钟即可完成

•快速石蜡包埋法操作过程

（1）  先取病变组织于AAF中固定3－5分钟。

（2）  95％酒精1分钟。

（3）  无水酒精1分钟

（4）  正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟

（5）  二甲苯1分钟

（6）  浸蜡1－2分钟

（7）  包埋

（六）组织切片

切片机类型：

旋转式切片机滑动式切片机

（六）组织切片

•石蜡切片的步骤：

1.切片前先把切片刀磨锋利，将修好蜡块置冰箱冷冻后放在切片机上

2.将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口成5-10度夹角。

3.再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。

4.根据需要调整切片厚度，一般3--5µm为宜。

切片的步骤：

5、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。

6、实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。

7、切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于水箱内展平，水温45--55℃为宜。

石蜡切片的步骤：

•8、切片附贴前，可先涂蛋白甘油，防止切片在染色时脱片；附贴后放温箱内（65℃左右）烘烤10--30min，也可置于微波炉内温火