有除草活性的放线菌菌株110固体发酵的研究.docx
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有除草活性的放线菌菌株110固体发酵的研究
有除草活性的放线菌菌株1-10固体发酵的研究
摘要
本实验通过配制固体培养基，对有除草活性的放线菌菌株1-10进行固体发酵。
固态发酵是没有或只有少量游离水存在，在具有可以满足微生物生长代谢的一定湿度的固态营养基质中进行的微生物发酵过程。
固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点。
固体基质不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、无机物和其他营养物的作用，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置，整个发酵过程跟微生物在自然环境中所发生的微生物反应相似。
通过对菌株进行固体发酵，然后用发酵悬浮液对草进行涂抹处理，利用固体发酵悬浮液对草进行处理后测其株防效。
从第1-12d得到的结果依次为：
0、3.15%、7.28%、16.92%、28.33%、47.54%、86.82%、59.41%、23.90%、12.42%、6.35%、1.72%，所以第7d为最佳发酵时间，株防效为86.82%。
关键词：
固体发酵；发酵时间；除草活性
ABSTRACT
Thisexperimentthroughthesolidculturemediumconfiguration,conductedsolidfermentationtotheactinomycetesstrains1-10whichhadherbicidalactivity.Thereisnooronlysmallamountoffreewaterinthesolidfermentation,whichisconductedinthesolid-statenutritionmatrixthatcanmeetthesuitablehumidityforthemicrobestogrowup.Solidfermentationhasmanyadvantagessuchaseasytocontrol,lowenergyconsumption,easytohandlethefermentationprocess,lowrequirementstothesterilecondition,noteasytopollutelargeareaandsoon.NotonlydoseSolidmatrixprovideacarbonsourceandnitrogensource,waterandinorganicnutrientsandother,butitalsoprovidesafixedlocationformicrobialgrowth,thewholeofthemicrobialfermentationprocessissimilartothemicrobialreactionsthatoccurinthenaturalenvironment.Throughsolidstatefermentationtothestrains,thendaubthegrasswithfermentationsuspension,usethesolidfermentationsuspensiondaubthegrassandtestthestrainscontroleffect.Theresultsasfollows:
0,3.1%,28.3%7.2%,16.9%,47.5%,86.8%,59.4%,12.4%,6.3%,23.9%,12.4%,6.35%,1.7%.Theseventhdayisthebestfermentationtime.
Keywords:
Solidfermentation；Fermentationtime;Herbicidalactivity
目录
1.前言1
1.1杂草的危害1
1.2除草剂研究进展1
2.材料与方法3
2.1实验仪器材料及常用的培养基3
2.2实验步骤3
2.3菌种的保存与鉴定4
3.结果与分析5
3.1固体发酵5
3.2测定最适发酵时间5
3.3菌种的鉴定6
4.讨论7
4.1固体发酵条件的控制7
4.2固体发酵的方法有利于放线菌的发酵7
5.结论8
5.1固体培养基的方法适合生长8
5.2掌握了最佳发酵时间8
参考文献9
致谢10
1.前言
1.1杂草的危害
杂草是是制约农作物稳产、高产的一个重要因素。
杂草与农作物争夺水分、养分、光照和空间。
许多杂草根系发达，吸收水分、养分和光照的能力强，苗期生长速度快，光合效率高，营养生长能快速向生殖生长过渡，具有干扰农作物的特殊性能，从而影响农作物的生长发育。
它们的主要危害体现在：
传播病虫害；影响作物产量影响人、畜健康；有些杂草的根、茎、叶、种子含有毒素,掺杂在作物中会影响人畜健康影响水利设施，增加管理用工和生产成本[1]。
1.2除草剂的研究进展
除草剂作为现代农业生产体系的重要组成部分，是农田除草技术中最可靠且最经济的手段。
自20世纪40年代开始使用以来，除草剂工业已有60多年的发展历史，迄今已成功开发出了一大批选择性除草剂[2]。
1.2.1化学防治
近年，杂草发生危害严重，在化学防治过程中，化学除草剂以其作用迅速、使用方便等特点，在20世纪50年代得到迅速发展。
长用的化学除草剂有：
甲草胺、乙草胺、草克死、施田补等。
但化学除草剂的大量使用也带来了许多负面的影响：
抗药性产生迅速，造成杂草防治困难；环境的污染，许多化学农药在食物中累积而影响人们的身体健康[3]。
1.2.2生物防治
从20世纪60年代起，国外就已经开始研究微生物除草剂，目前报道的有除草剂潜能的微生物类型包括：
真菌、细菌、病毒、放线菌和线虫。
人们已经发现了多种生物农药[4]。
常用的生物除草剂种类有：
环乙烯酮类、有机磷类、苯氧丙酸酯类等。
其中乙酰辅酶A羧化酶是化学除草剂的一个重要靶标，发现于1958年，是生物素包含酶，它在生物体内催化乙酰辅酶A羧化，形成丙二酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物，是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶[5]。
随着生态农业和有机农产品市场的不断发展，生物农药受到越来越多的重视，并显示出了强劲的发展势头，因此开发并大量生产具有除草活性的生物农药具有巨大的潜力。
放线菌是产生抗生素种类最多的一类微生物，目前世界上已报道的上万种抗生素中，大约80%是由放线菌产生的，放线菌类抗生素在许多领域都有突出表现。
选择出适合于除草的放线菌对农业生产有很重要的意义。
2.材料与方法
2.1实验仪器、材料及常用的培养基
2.1.1实验仪器及材料
鬼针草种子，托盘，pH试纸，试管，三角瓶，灭菌框，高温高压灭菌锅，接种棒，烧杯，量筒，酒精灯，超净台，泥土，摇床，电子天平，恒温培养相，发酵罐，电炉。
2.1.2常用的培养基
A2培养基：
葡萄糖5g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、淀粉20g、酵母粉5g、黄豆粉10g、CaCO33g、CoCl20.002%、pH7.5、水1L
LB培养基：
蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、pH7.0-7.5、水1L（固体培养基加入琼脂，加入量为2%）
查氏培养基：
蔗糖30g、NaNO33g、K2HPO41g、MgSO40.5g、KCl0.5g、水1L、pH6.0-6.5、琼脂：
20g
2.2实验步骤
2.2.1固体发酵
制作LB斜面培养基，取有除草活性的放线菌菌株1-10进行接种并放入28℃下的恒温培养箱内进行培养。
制作LB液体培养基，挑取斜面培养基上长势单一的菌落，接种于LB液体培养基内并放入28℃下的恒温摇床（转速150rpm）内进行培养。
制作固体发酵培养基，主要成份：
蔗糖5g，马铃薯5g，黄豆粉10g，豆腐渣5g，鸡肠5g，酒糟5g，水1L，将其充分混匀，调pH7.0，CaCO33g，CoCl20.002%，加入麸皮，米糠，混匀。
使其潮湿并有疏松状时停止加入。
装入发酵瓶，每瓶装入1/5体积（因为发酵瓶的体积为250ml，所以每瓶加入50ml的培养基）的发酵培养基，密封。
将其放入高温灭菌锅内，121℃灭菌2到3小时。
接种时按无菌操作原理进行。
放入超净台内用紫外灯照射30分钟左右。
将已培养出的摇瓶菌液放入超净台内，摇瓶内的除菌体外的其余培养液除去，将发酵瓶揭开，把三角瓶内剩余的菌液及菌体全部倒入发酵瓶内，然后密封，并放入28℃的恒温培养箱内进行培养。
2.2.2测定最适发酵时间
对杂草处理，将试样土壤定量装置盆钵4/5处，采用顶部浇灌，使土壤完全润湿至饱和状态。
收集鬼针草种子。
将预处理的供试杂草种子均匀播撒在土壤表面，覆土1.0cm左右，播种后保持土壤充分湿润，移入温室内正常管理，培养杂草至二叶期。
从发酵的第一天开始测定发酵产物对鬼针草的株防效。
将发酵产物加入3倍体积的蒸馏水稀释，不断搅拌30-40分钟后直接用毛笔的笔尖蘸取发酵悬浮液涂抹在已经培养好的鬼针草叶片上，每天处理3瓶，每瓶悬浮液涂抹40株草。
并取一瓶空白发酵悬浮液作对照。
保持土壤充分湿润，移入温室正管理[7]。
测定最适合的发酵时间。
处理后定期检查杂草的生长状况。
处理后3d到5d，检查各处理地上部分的受害特征，统计受害的杂草数目，记录除草活性，存活杂草株数，同时描述受害特征。
测出株防效，以株防效来找出最适发酵时间。
主要症状有：
颜色变化（黄化、白化等）；形态变化（新叶畸形、扭曲等）；生长变化（脱水、枯萎、矮化、簇生等）。
2.2.3绝对值数测调查法
根据调查数据，按公式
（1）计算各处理的鲜重防效和株防数，单位为百分率（%），计算结果保留小数点后两位[8]。
…………………………………..………………………………
（1）
公式
（1）中：
E为鲜重防效（株防效）、C为对照杂草地上部分鲜重（或杂草株数）、T为处理杂草地上部分鲜重（或未受害杂草株数）
2.3菌种的保存与鉴定
2.3.1菌种的保存
对于菌种的保存采用的方法是：
将甘油与水混合，甘油所占比例为30%。
将其装入甘油管，占塑料管的体积比为20%。
将装入甘油的塑料管放入灭菌锅内灭菌30分钟。
将已培养好的长势优良的菌种在无菌条件下从斜面上转入塑料管内，将已存有菌种的塑料管放入-4℃的冰箱里面，从而完成菌种的保存[9]。
2.3.2菌种的鉴定
菌种鉴定采用的是埋片法。
制作查氏培养基平板，用镊子在培养基上挖个长方形的小槽，无菌条件下，挑取放线菌菌株1-10的单菌落接种与小槽的一个角上，并在倾斜插入盖玻片，然后密封平板，做好标记。
放入28℃的恒温培养箱内进行培养。
30d后取出盖玻片在显微镜下进行观察。
3.结果与分析
3.1固体发酵
LB斜面培养菌种现象：
过3-4天在斜面培养基上可以看到白色且干燥的菌落，其长势与接种量的多少有关。
LB摇瓶培养菌体现象：
过3至4天可以在摇瓶内看到一团不规则的白色丝状的菌体相互缠绕。
其长势跟接种量的多少有关。
固体发酵菌体现象：
可以看到菌体依附在固体发酵培养基上生长。
在菌体发酵过程中固体培养基的水分决定了菌体的生长情况，其长势最好的是水分最合适的，其次是水分较多的，水分特别少的其长势较差。
3.2测定最适发酵时间
利用固体发酵培养出的放线菌菌株1-10对草进行处理后,经统计并用公式
（1）计算其株防效，得到以下数据：
表1不同发酵时间对应的株防效
发酵时间（d）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
对照组（%）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
株防效（%）
0
3.1
7.2
16.9
28.3
47.5
86.8
59.4
23.9
12.4
6.3
1.7
上表是实验得到的结果：
最适发酵时间是第7天。
由统计数据可以说明对照组用空白发酵液处理后对草的生长没有影响。
图1.不同发酵时间对应的株防效
分析：
图1说明发酵时间不同，其除草活性也不一样。
发酵时间的影响：
发酵时间过短，由于发酵产物量较少，消耗的培养基成分也较少，不仅效果不明显，还导致培养基的有效价值没有被充分利用而造成浪费。
发酵时间过长，由于培养过程中培养基有效成分有限，不能较长时间供给营养，从而产物被分解，导致发酵效果降低。
3.3菌种的鉴定
在40×10倍的显微镜下观察，经实验的初步鉴定，此菌种为链霉菌。
4.讨论
4.1固体发酵条件的控制
pH的控制。
固体培养基的制作如何控制好发酵的pH值，是固体发酵的一个难点。
pH的测定：
取部分基质，加入少量的水分，充分混匀，用pH剂直接测量，但是这种方法测定的pH结果往往比实际值高出0.1-0.2。
pH的调节：
固态基质不比液态溶液，调节pH值较难，现在一般采取均匀喷洒一定量的碱、酸溶液在基质上，达到调节的目的，也可以加入一定量的强碱弱酸盐或强酸弱碱盐固体粉末进行调节，如加入碳酸钙可以使固态基质的pH值升高。
尽管如此，由于发酵过程会引起pH值的变化，现实中pH值的控制仍是一个难点。
温度的控制。
在固态发酵中，随着发酵的进行，发酵产生生物热，由于固体的导热性差，使得这些热量很难散发出来。
在这种情况下，发酵基质中常形成温度梯度，局部温度偏高。
特别是在对数生长期，菌体生长旺盛，产热快，造成固体基质板结，有时局部温度过高，对微生物的生长和产酶带来很大的影响。
水分含量的影响。
水分含量对发酵有直接影响。
发酵水活度与液态发酵相比，固态发酵中的水含量非常有限。
水在固态发酵中不仅为微生物生长提供营养充足的水环境，也直接影响到微生物对氧的利用。
水活度要求越低，被杂菌污染的概率也会降低，这也是真菌在固态发酵中的优势之一。
含水量过高，空隙率降低，不利于通风降温，有利于细菌的生长；含水量过低，空隙率增加，由于通风和散热带来的水分流失会影响到微生物的生长，并直接影响到最终产物的产量。
在发酵程中，由于不断通气及生物热使温度上升，这时应根据实际情况进行补水，确保菌体的正常生长[10]。
4.2固体发酵的方法有利于放线菌的发酵
在固体发酵过程中，放线菌的菌丝体能紧密接触纤维素类物质，有利于发酵的进行，因此固态发酵正好为菌体提供了良好的生长环境。
固态发酵生产成本较低，由于固态发酵采用廉价易得的农作物废料作为生产原料，生产成本大幅下降[11]。
但在发酵条件的调控方面，固态发酵比液态发酵尚有不足，主要表现在传质、传热方面研究较少，这与现在工业化水平的高低也存在一定关系[12]。
5.结论
5.1固体培养基的制备方法适合生长
实验是采用具有除草活性的放线菌菌株1-10进行固体发酵，用菌悬液对草进行涂抹处理，通过对草的株防效来反映其活性的大小。
放线菌适合于固体发酵，在固体培养基的过程中，培养基的组分与营养物质的比例对实验是否成功起了决定性的因素。
培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。
它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；适宜的pH值；合适的渗透压；保持无菌状态。
所以培养基的配置是培养微生物必须考虑的重要因素。
通过实验结果可以表明实验的设计的发酵培养基是合理的，方法是正确的，对放线菌菌株1-10的固体发酵是有用的。
5.2掌握了最佳发酵时间
本实验的一个重点就是测出菌体发酵的最佳发酵时间。
实验结果表明在第7d进行处理的株防效可以达到86.8%，是实验测到的最佳发酵时间。
掌握最佳发酵时间是十分重要的。
在实际生产中，它可以控制其发酵过程中的对营养物质的需要量、补料投放的多少、出料的时间等，而这些因素是影响到企业产量、公司的利润。
通过实验找到最佳发酵时间,是本实验成功的标志。
参考文献
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[12]孙巍,刘学铭.酶的固体发酵生产研究进展[J].江西农业大学生物科学与工程学院,2008,
（2）:
18.
致 谢
在实验即将完成之际，我的心情万分激动，从论文的选题、资料的收集到论文的撰写编排过程中，我得到了许多热心的帮助。
我要感谢王栋老师，本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下顺利完成的，倾注了老师大量的心血。
是他提供了我实验研究的方向，并对我的研究提出了很多宝贵的意见。
他渊博的学识、平易近人的人格魅力令我十分钦佩，是我以后学习和工作的榜样。
在他的引导下，不仅使我树立了学习目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物、为人处事之道。
还要再次感谢王老师对我的关心和照顾，在此表示最诚挚的谢意。
2011年6月
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