理财CB910300G泛素蛋白酶体系统性发现其底物发掘新作用机制及其生物学意义.docx

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理财CB910300G泛素蛋白酶体系统性发现其底物发掘新作用机制及其生物学意义

项目名称：

泛素－蛋白酶体：

系统性发现其底物、发掘新作用机制及其生物学意义

首席科学家：

秦钧中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

起止年限：

2012.1至2016.8

依托部门：

总后勤部卫生部

一、关键科学问题及研究内容

拟解决的关键科学问题：

蛋白质修饰在细胞行为和个体生理活动中起着极其重要的作用，相关研究是近年来生物医学研究的热点之一。

泛素化修饰是最广泛的蛋白翻译后修饰之一，参与了包括蛋白转运、降解、细胞信号调控等诸多细胞生物学过程。

细胞内蛋白质泛素化系统的调控和作用机制极为复杂，泛素连接酶底物的鉴定更是研究的关键点和瓶颈。

泛素化与其他翻译后修饰间的相互调控也已成为当前生命科学的研究热点。

本项目拟利用最先进的大规模泛素化蛋白的纯化和检测的策略，系统鉴定RING和HECT两大类泛素连接酶家族的底物并加以功能确证，全面阐明泛素化系统在重大生理病理过程中的作用，揭示泛素化与其他类型翻译后修饰间的相互作用关系，解析泛素-蛋白酶体系统的重要蛋白质的结构，为全面推进我国泛素化研究，为重大疾病的诊断和治疗提供理论依据。

本项目拟解决的关键科学问题包括：

1、怎样规模化鉴定泛素-蛋白酶体系统中的泛素连接酶的底物？

2、细胞泛素-蛋白酶体系统中有代表性的泛素连接酶家族（比如SCF和SMURF家族）的底物蛋白质组是什么？

3、UPS体系中的SCF泛素连接酶家族有哪些具体的蛋白可作为肿瘤治疗的靶点？

4、细胞中还有哪些含有全新的UBD蛋白，它们的功能是什么？

5、泛素化蛋白质组在DNA损伤修复中的变化是什么？

起什么作用？

是怎样被调控的？

乳腺癌抑癌蛋白BRCA1/BARD1的底物到底是什么？

6、其他的修饰，如乙酰化、类泛素化（SUMO）、糖基化，对泛素化的调控机理和行为是什么？

这些相互应答（cross-talk）对肿瘤等代谢类疾病和生殖发育的发生发展的作用是什么？

7、泛素-蛋白酶体系统（酶、底物及其调控分子）在调控生理、病理过程中的分子机制及分子结构的基础是什么？

主要研究内容：

1、发现E3泛素连接酶底物和全新的含有UBD蛋白的方法和各种支持泛素化研究的蛋白质组学方法

1）利用qUBApulldown联合质谱技术大规模鉴定泛素化蛋白以及蛋白泛素化位点；

2）改进已有的qConCAT/SILAC技术鉴定和定量技术平台，寻找E3泛素连接酶底物组；

3）建立E3泛素连接酶—底物蛋白组的对应网络；

4）生物信息学初步归纳分析E3--底物系统的信号通路及在细胞/机体内作用。

2、UPS系统的生理病理作用

1）发现以Smurf1、NEDL1、NEDL2为代表的HECT类泛素连接酶和SCFE3连接酶家族的底物蛋白组，研究其在人类重大疾病，如癌症等过程中的作用；

2）定量筛选、鉴定重大疾病相关泛素化蛋白或其调控蛋白，研究其在疾病发生、癌变中的分子机理和作为药靶的潜力；

3）对于具有较大潜在药物靶点价值的基因，构建敲入/敲除小鼠，深度研究其生物学功能。

3、蛋白质其他翻译后修饰与泛素化的相互作用（crosstalk）研究

1）系统性分析乙酰化、类泛素化、糖基化等蛋白翻译后修饰与泛素化修饰的相互关系；

2）对于具有特别重大意义的翻译后修饰相互作用位点进行小鼠层面上的基因干预（修饰位点敲除/位点修饰永久化），进行更加深入的研究，讨论其在生理病理过程中的功能。

4、UPS系统的结构生物学研究

1）采用x-ray晶体衍射/NMR技术解析具有代表性泛素化系统蛋白结构；

2）对于已知的E3-底物复合物和在本项目中新发现的E3-底物组，进行复合物结构解析；

3）比较泛素化位点以及与其相互作用的蛋白修饰位点突变状况下，对蛋白/蛋白复合物结构的影响，进而研究这些位点的功能。

二、预期目标

发展系统研究泛素酶体系的蛋白质组学方法，大规模鉴定E3泛素连接酶家族的底物，梳理其它蛋白质翻译后修饰和泛素化的相互关系，以揭示蛋白质修饰及降解的分子机理及其生物学意义，使我国在此领域的研究占据世界领先地位。

通过该项目的实施，阐明重大疾病的分子基础，为寻找和鉴定具有重要应用前景的治疗疾病的药物靶点奠定基础。

具体目标为：

1）发展一套高通量和高准确度的泛素连接酶底物发现和验证的技术平台；

2）在蛋白质组水平建立多种未知SCF亚基泛素连接酶和9种SMURF家族泛素连接酶与底物的对应关系；

3）建立针对SCF泛素连接酶的高通量筛选体系来找寻肿瘤分子靶点，系统阐明筛选到的5-10个SCF亚基在肿瘤发生中的作用，获取它们作为抗肿瘤新靶点的证据,并阐明其抗肿瘤分子机制；

4）鉴定在DNA损伤修复中起关键作用的泛素化蛋白网络，发现BRCA1/BARD1底物；

5）发现组织特异性蛋白酶体并阐明其功能；

6）研究泛素化与其他翻译后修饰之间动态交互作用机制及其生理、病理意义；

7）通过结构生物学研究，解析泛素化反应相关的分子机制；

8）发表高水平SCI论文（影响因子5以上）30篇以上，力争在国际一流（影响因子8以上）杂志上发表10-15篇论文，申请专利5-10项。

培养优秀青年科研骨干及学术带头人5人以上，博士生或硕士生40人。

三、研究方案

蛋白质修饰及降解是极为复杂而重要的生物学过程。

本项目瞄准国际科学发展的最前沿和本领域中的关键科学问题，抓住蛋白质组学技术上的突破带来的机遇，依托我们在世界上领先的蛋白质组学研究平台，发展和运用崭新的泛素化分析方法，结合各课题组生物功能研究的特长和优势，集中资源、整合技术、充分协作，以一个攻关团队的方式重点突破重大科学问题。

我们将以UPS系统为重点，综合应用蛋白质组学，分子生物学、细胞生物学、生物化学、分子遗传学、结构生物学、生物信息学以及系统生物学等多学科交叉手段，系统地描绘这一生物过程的分子机理及其生物学意义，为解决人类重大疾病诊治所迫切需要的重大理论和技术问题提供创新性的研究成果。

技术途径

本项目将根据研究任务和目标，充分利用蛋白质组学技术，发现一批具有重要功能的泛素化蛋白组，为在基因水平、蛋白质水平、细胞与组织水平和整体水平上阐明这些重要蛋白质的功能与调控机制提供高质量的线索，然后用转基因或基因敲除动物进行深度机制研究。

1.寻找泛素连接酶底物的方法：

泛素连接酶底物的寻找是本项目的关键点，我们将从三个角度探索其有效研究方案：

（1）直接的方法。

在细胞中过表达泛素连接酶或其无活性的突变体，或用RNAi敲低E3基因，在体（细胞）外用GST-qUBA纯化泛素化蛋白，比较泛素化蛋白的变化，以推测底物。

（2）间接的方法。

由于直接法难以获得立刻被降解的底物，对这类底物可采用比较蛋白丰度的方法以推测底物。

我们将联合采用SILAC和质谱多反应监测（MRM）技术，最大限度获取高覆盖的比较蛋白谱，不使被降解的底物漏网。

SILAC和MRM技术路线各有千秋,前者可大量发现蛋白,而后者更灵敏，定量范围更宽；二者结合将有利于最大限度覆盖和定量蛋白，提高发现底物的胜率。

（3）蛋白相互作用的方法。

因为底物在泛素化的过程中会与泛素连接酶发生短暂的相互作用，所以通过发现泛素连接酶相互作用蛋白也是一种发现底物的方法。

我们将尝试用在维持弱相互作用的条件下免疫共沉淀泛素连接酶的方法来发掘和鉴定新的相互作用蛋白，另外我们也将采用酵母双杂交的路线来实现这个目的。

我们将对这两条技术路线所产出的结果进行验证，去伪存真，保证数据的可靠性。

与泛素连接酶相互作用的蛋白存在两个可能：

底物或泛素连接酶的调控物。

通过验证实验可以进一步确定其归属。

我们也可结合直接和间接法所发现的候选蛋白加以甄别，若是底物，则在直接法中应为泛素化蛋白，在间接法中则为丰度发生显著变化的蛋白。

否则可能是泛素连接酶的调控物。

我们要特别强调，虽然上述的三种方法，单独每一种不一定会给出确定的答案，但三种方法的有机结合，将会逐渐缩小发现底物的包围圈。

此外，基于我们前期积累的内源蛋白复合体及酵母双杂交相互作用的数据库，我们相信对发现泛素连接酶的底物会处在一个极有利的地位。

而这种整合不同的方法，利用源于同一实验室的高通量数据，来保证质量排除噪音的方法，会是今后利用高通量数据解决生物学问题的有效途径。

2.验证泛素连接酶底物的方法：

上述方法只是找到泛素连接酶的候选底物，要证明是真正的底物还需至少二个步骤。

第一，我们将采用体外泛素酶反应的方法，用从E.Coli.中表达纯化的E1、E2和E3酶来进行体外泛素化反应，以证实该候选底物的确可被相应的泛素连接酶所泛素化；第二，我们将确定在体内该底物的泛素化位点，并验证体外反应发生在相同的位点。

这样，结合上述两种方法，我们将最终确定泛素连接酶底物。

3.泛素酶底物的功能研究：

突变泛素泛素酶底物的泛素化位点，研究该位点在蛋白质功能执行中的作用。

利用各种手段和技术来研究其蛋白质功能及其生物学效应。

在分子生物学水平，细胞组织水平上深入研究基因/蛋白质的功能及调控网络。

4.深度解析翻译后修饰：

利用已有的蛋白质组学分析平台，我们可以对纳克级（痕量）的蛋白修饰位点进行鉴定和定量。

通过比较蛋白各种修饰形式含量的变化，研究翻译后修饰间的相互作用和协同性。

采用突变某一修饰位点的方法，研究其对于其他各种翻译后修饰的影响。

5.结构生物学的研究方法：

采用x晶体衍射或核磁共振的方法，解析泛素化蛋白系统中重要成员的结构，揭示泛素化反应相关的分子机制。

6.基因敲除小鼠模型的构建：

前期细胞模型的功能效果需要在动物模型中得到证实。

我们将通过转基因或基因敲除动物观察靶基因的作用与功能，以观测细胞和动物水平上的调控机制是否一致。

四、年度计划

年度

研究内容

预期目标

第

一

年

（1）SCF、Smurf家族和其他E3泛素连接酶底物鉴定。

高通量鉴定SCF灭活/代表性F-BOX蛋白下调后发生积聚的蛋白。

鉴定在肿瘤组织中过表达、具有癌基因活性和促进肿瘤细胞生长功能的候选SCF亚基。

制备Smurf1和Smurf2单敲低和双敲低的HCT116细胞系，开展SILAC实验；启动NEDL1和NEDL2的基因敲除小鼠的制备。

（2）建立体外富集纯化体系，分析在DNA损伤和修复过程中被泛素化的蛋白。

（3）构建泛素化蛋白质参考数据库。

（4）研究嵌膜的GTP酶在细胞器上的定位机制及泛素化修饰。

（5）完善Rpn13基因敲除小鼠模型，进一步验证精子发生过程中组蛋白通过睾丸特异性蛋白酶体降解。

（6）对Smurf及其调控蛋白、生精细胞特异性蛋白酶体相关的PA200和alpha-4s等蛋白质展开初步晶体学研究。

（1）建立开展泛素连接酶底物研究的直接研究方法，初步实现5个F-box蛋白质的底物规模化鉴定和Smurf家族底物的规模化质谱鉴定分析。

获得Smurf1和Smurf2的相同和相异的底物谱，构建基因敲除所用的打靶载体。

鉴定出3个左右在肿瘤组织是过表达、具有癌基因活性和促进肿瘤细胞生长功能的候选SCF亚基。

（2）基于弱相互作用条件下的免疫共沉淀以及酵母双杂交等技术，建立采用蛋白质相互作用研究方法，开展规模化泛素连接酶底物鉴定的研究策略

（3）发现在DNA损伤修复过程中的蛋白质泛素化修饰网络。

（4）初步建立参考数据库访问、浏览和查询界面。

（5）建立嵌膜GTP酶在内质网与线粒体互换的体系，分别检验其泛素化修饰的情况。

（6）建立Rpn13基因敲除小鼠模型；明确精子发生过程中组蛋白通过睾丸特异性蛋白酶体降解。

（7）鉴定泛素连接酶底物PEPCK1、ACL、RNF4相互作用蛋白，寻找并发现参与蛋白O-GlcNAc糖基化修饰和泛素化修饰的酶。

（8）尝试在原核体系或昆虫细胞中表达目标蛋白，对于纯化得到的蛋白进行初步的结晶条件筛选。

（9）发表影响因子5.0以上研究论文5-8篇。

年度

研究内容

预期目标

第

二

年

（1）继续开展SCF、Smurf家族等泛素连接酶底物鉴定。

利用Western验证SCF泛素连接酶F-Box家族底物SILAC-MRM鉴定结果。

开展候选SCF亚基作为肿瘤标志物分析及其与肿瘤分期和患者预后相关性分析。

（2）对Smurf1和Smurf2的底物谱进行生物信息学分析，将NEDL1、NEDL2基因敲除所用的打靶载体进行ES细胞筛选，将中靶ES细胞进行小鼠囊胚注射。

（3）建立泛素化修饰蛋白信息的文本挖掘和注释平台。

（4）定量被泛素化修饰的蛋白在DNA损伤应答修复过程中的动态变化，利用siRNA干扰的方法研究BRCA1/BARD1等蛋白在DNA损伤修复过程中的基本生物学功能。

（5）解析atlastin等蛋白的泛素化修饰机制及其在细胞器动态变化、增殖、凋亡中的作用，研究嵌膜GTP酶对细胞器动态的影响。

（6）研究敲除Rpn13基因对睾丸中组蛋白及其它关键蛋白降解的影响，并研究它们调控精细胞发生和分化的机理。

研究组蛋白修饰对其降解的调控机制。

（7）建立E3与乙酰化、类泛素化、O-GlcNAc糖基化修饰底物的对应关系

（8）对于前一年获得晶体的目标蛋白进行结晶条件优化、衍射数据收集和结构解析。

（1）通过Western验证，获得了一批在SILAC-MRM和Western中均积聚的SCF家族底物蛋白。

证实候选SCF亚基是否为新型肿瘤标志物，明确其与肿瘤分期和患者预后的相关性。

（2）构建Smurf1和Smurf2的底物谱，并揭示其特异和共同的生理功能。

拿到中靶的ES细胞，制备NEDL1和NEDL2的基因敲除小鼠。

（3）发现一系列被泛素化修饰的蛋白及动态变化，确定3-5个新蛋白在DNA损伤修复过程中的基本生物学功能。

（4）解析atlastin等蛋白的泛素化修饰机制及其在细胞器动态变化、增殖、凋亡中的作用，通过对嵌膜GTP酶泛素化修饰的调控，揭示泛素化对内质网和线粒体等动态变化的影响。

（5）了解Rpn13对睾丸中组蛋白及其它关键蛋白降解的影响及组蛋白修饰对其降解的调控机制。

（6）阐明E3与PEPCK1、ACL的相互作用受到乙酰化修饰调控的分子机理。

阐明E3与RNF4的相互作用受到类泛素化修饰调控的分子机理。

寻找并发现参与蛋白O-GlcNAc糖基化修饰和泛素化修饰的酶，阐明E3与底物相互作用受到O-GlcNAc糖基化修饰调控的分子机理。

（7）进一步尝试蛋白在哺乳动物细胞中进行表达、其它结晶条件和结晶方法，优化结晶条件。

收集已获得的晶体衍射数据，应用衍射数据解析结构。

（8）发表影响因子5.0以上研究论文8-10篇。

年度

研究内容

预期目标

第

三

年

（1）发掘泛素结合结构域蛋白质，完善泛素化蛋白质参考数据库。

（2）通过蛋白相互作用分析，鉴定候选底物与F-Box蛋白和其他SCF核心组成亚基是否相互作用。

敲低候选SCF组成亚基，在不同肿瘤细胞系中验证是否具有肿瘤细胞杀伤效果。

（3）对新发现的Smurf1和Smurf2的底物进行部分深入验证；获得其他E3的底物谱；初步系统分析NEDL1和NEDL2基因敲除小鼠的表型；进行NEDL1和NEDL2的底物挖掘研究。

（4）分析DNA损伤修复过程中被泛素化修饰蛋白的修饰位点，寻找其对应的E3连接酶。

（5）进一步研究atlastin等嵌膜GTP酶对细胞器膜融合的影响。

（6）探索哺乳动物或酵母组蛋白的降解机制，及其对精子或单倍体细胞发生、基因转录、DNA损伤修复等的调控机制。

（7）研究泛素化系统与其他修饰之间协同作用的生理及病理意义

（8）对获得的大规模的目标蛋白进行克隆和表达尝试。

（1）建立将以泛素化蛋白为中心的参考数据库，包括泛素化蛋白的序列、结构、功能、相互作用和进化等信息。

（2）实现超过20个F-box蛋白质的底物规模化鉴定。

证实部分候选底物与F-Box蛋白和其他SCF核心组成亚基存在相互作用。

证实对候选SCF组成亚基干预后的肿瘤细胞杀伤效果。

（3）对Smurf1和Smurf2的底物的验证揭示其生理功能的分子机制。

找到NEDL1和NEDL2的生理功能线索和底物分子。

（4）阐明DNA损伤修复过程中被泛素化修饰蛋白的修饰位点及相应的E3连接酶，研究该连接酶的功能。

（5）阐明泛素化修饰影响嵌膜GTP酶介导膜融合的可能机制。

（6）初步了解组蛋白的降解对精子或单倍体细胞发生、基因转录、DNA损伤修复等的调控机制。

（7）阐明乙酰化和泛素化协同作用对PEPCK1和葡萄糖代谢（主要是糖异生通路），ACL和脂肪酸代谢，生物膜合成以及细胞生长的调控。

阐明类泛素化对RNF4泛素化的影响，以及在生理条件下这种类泛素化和泛素化之间的交互应答对斑马鱼胚胎造血和系统发育的影响。

寻找并发现参与蛋白O-GlcNAc修饰和泛素化修饰的酶，解析其信号传导通路。

（8）对于前一年获得的晶体结构进行深入细致的结构比较与分析，提交1~3个结构坐标至PDB数据库。

对获得的大规模的目标蛋白进行克隆、筛选，找到可以进一步进行结构生物学研究的目标蛋白。

（9）发表影响因子5.0以上研究论文8-10篇。

年度

研究内容

预期目标

第

四

年

（1）发现和验证新型UBD，综合使用实验和信息学方法重构和分析人泛素化体系的蛋白质网络。

（2）通过蛋白泛素化位点分析和蛋白降解半衰期分析等经典方法确认SCF/F-box的底物。

检验哪些SCF底物集聚，并在肿瘤细胞系中过表达聚集的该底物，以检测是否会杀伤肿瘤。

（3）对确定的Smurf1和Smurf2的底物进行生理功能分析。

深入分析NEDL1和NEDL2基因敲除小鼠的表型，并以此为依据验证发现的底物分子。

（4）研究泛素化修饰如何调控BRCA1/BARD1等蛋白在DNA损伤修复中的功能。

（5）鉴定泛素化修饰影响细胞器动态变化的新因子。

（6）尝试在其它组织中寻找新类型的蛋白酶体，阐明这些组织特有的蛋白酶体的作用机制降解机制。

研究组织特异性蛋白酶体、26S蛋白酶体及免疫蛋白酶体在相关组织的蛋白质降解中的协同性，及其调控细胞发育和分化的关键机理。

（7）基于泛素化系统与其他修饰之间协同作用，寻找有效的靶点，进行基因干预（修饰位点敲除/位点修饰永久化），开展细胞水平（体外）和小鼠层面（体内）的实验。

（8）对前一年获得表达的目标蛋白进行纯化、复合物共结晶和结晶条件优化。

（1）结合qUBApull-down实验，根据目标蛋白质在SDS-PAGE中的迁移特征，规模化鉴定候选UBD蛋白质，进一步根据鉴定蛋白质的结构域特征，采用GST融合等技术，确认新的UBD蛋白质。

建立一个完整的泛素化体系成员和功能关联的列表。

（2）蛋白泛素化位点分析和蛋白降解半衰期分析确认部分新的SCF/F-box的底物。

发现和验证在灭活潜在靶点后发生积聚的SCF底物及其肿瘤细胞杀伤活性。

（3）发现Smurf1和Smurf2的特异和共同的生理性底物。

确定NEDL1和NEDL2基因的功能，找到其生理底物分子。

（4）阐明3-5个新蛋白在DNA损伤修复中被泛素化修饰的分子机理。

（5）筛选特定细胞器上的底物，确认1-2个可能参与细胞器动态变化的泛素化底物。

（6）解析组织特异性蛋白酶体、26S蛋白酶体及免疫蛋白酶体在相关组织的蛋白质降解中的协同性。

（7）通过基因干预，实现乙酰化和泛素化相互作用对PEPCK1、ACL的功能调控，实现RNF4类泛素化和泛素化相互作用对斑马鱼胚胎造血和系统发育的调控。

（8）对于纯化得到的蛋白进行初步的共结晶条件筛选。

对于SCF或Smurf的底物，尝试两者与其各自底物的共结晶；对于新的UBD，尝试其与泛素的共结晶；对于已获得的结晶条件进行优化。

（9）发表影响因子5.0以上研究论文10-15篇。

年度

研究内容

预期目标

第

五

年

（1）通过整合前期研究结果，建立完善系统的泛素化蛋白质发掘和验证技术体系。

（2）综合遗传网络、转录调控网络，以及本项目产出的各类数据，建立相应的网络模型，研究体系的稳定性，通过计算模拟发现重要功能线索，并同实验课题组合作，研究泛素化修饰在生理病理过程中的基本机制。

（3）研究所鉴定SCF底物在调控肿瘤细胞生长中的功能，特别是对细胞周期和凋亡的影响。

研究SCF靶点灭活后由某些特定底物介导的肿瘤细胞杀伤机制（细胞凋亡、细胞自吞噬和细胞衰老）。

（4）整合Smurf1和Smurf2底物的生物信息学信息和生理功能。

整理NEDL1和NEDL2功能和其底物分子发现。

（5）筛选BRCA1/BARD1的生理底物，研究该底物的功能。

（6）深入研究新泛素化底物对细胞器动态的影响。

（7）研究各种蛋白酶体降解蛋白质的调控机制，及其生理病理学意义。

（8）基于泛素化系统与其他修饰之间协同作用，寻找有效的药物靶点。

（9）对前一年获得的晶体进行数据收集和结构解析。

（1）建立对泛素化蛋白质的深度覆盖技术策略，扩展该策略在肿瘤等重要生理病理条件下的应用潜力。

（2）生物信息学为本项目各课题的实验研究提供功能研究线索和技术支持。

（3）阐明所鉴定SCF底物在调控肿瘤细胞生长中的功能。

阐明SCF靶点灭活诱导肿瘤细胞杀伤的分子机制。

（4）揭示Smurf1和Smurf2特异的底物和生物学功能。

揭示NEDL1和NEDL2在动物体内发挥的真正生理作用。

（5）发现BRCA1的生理底物及其具体生物学功能。

（6）结合细胞生物学和生物化学等方法，阐明新泛素化底物对细胞器动态调控的机制。

（7）提出1－2种新的蛋白酶体降解蛋白质的机制。

（8）基于泛素化和其他修饰的相互作用，寻找2型糖尿病、肿瘤、APL治疗的药物靶点

（9）对已获得的晶体进行衍射数据的收集；应用衍射数据解析结构，提交3~5个结构坐标至PDB数据库；与已有E3连接酶与底物的结构关系进行比较，与已有的UBD与泛素的结合模式进行比较。

（10）发表影响因子5.0以上研究论文15-20篇。

通过本项目的实施，培养优秀青年科研骨干及学术带头人10人以上。

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