瘤胃发酵试验方法.docx

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瘤胃发酵试验方法

瘤胃体外发酵方法

绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰

1.2瘤胃液的采集和培养基制备

瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料（精料组成,玉米:

豆粕=2:

1）,自由饮用清洁水。

于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:

2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。

每升培养基中含有15.71mgCaCl2·2H2O,11.90mgMnCl2·4H2O,1.19mgCoCl2·6H2O,9.52mgFeCl3·6H2O,0.143gMgSO4·7H2O,76.2mgNaOH,0.95gNH4HCO3,8.33gNaHCO3,l.36gNa2HPO4,1.48gKH2PO4,2.98gNa2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺（Menke等,1979）

1.3试验设计

试验根据绞股蓝皂试添加量（0、5、10、20和40mL/60mL）分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。

取60mL瘤胃液与培养基混合液（瘤胃液:

培养基二1:

2）分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成（3:

7）,精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉（过1mm筛）。

发酵瓶封盖!

气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。

第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24,48,72,96,120h,计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。

1.4指标测定

1.4.1产气量的测定

根据Theodorou等（1994）的方法,使用气压转换器（IGER,UK）定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。

根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。

4.3挥发性脂肪酸的测定

取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸（内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g）混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。

测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。

优化胡伟莲方法测定VFA（胡伟莲,2005）,柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃）。

高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。

4.4氨态氮浓度测定

将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。

测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析（weatherburn,1967）"

4.5微生物蛋白浓度测定

取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱"测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。

取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟（Makkar等,1982）。

取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。

1.4.6原虫计数

将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。

改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数（Newbold等,1987。

4.7氢的还原力

根据Demeyer（1991）挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:

2Hr（%）=（4M+2P+2B）*100/（1A+P+4B）

其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执（以上均为净摩尔产量）。

对瘤胃微生物发酵参数的影响

1材料与方法

1.1试验动物、日粮组成与试验设计

试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕（代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%）。

每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。

两次于8:

00和17:

00点等量瘤胃灌注。

对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。

2样品采集与分析

饲料采食量分别在每期的11-13天测定。

记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量"饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。

取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:

1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定（Jouany,1982）,其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸（内标测定vFA）（Cottyn和Boucque,1968）.冷冻瘤胃液解冻后于12,ooo×g/min在4℃条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。

气相色谱仪（岛津,GC-14B,日本）具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜（Supelco,美国）。

汽化室温度为180℃,柱温135℃,检测室温度180℃，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量400mL/min。

根据Demeyer（1991）的方程计算CH4产量和氢利用率。

方程如下:

瘤胃可发酵有机物（FOM）gmol-1vFA=162（0.5A+0.5P+B）v

CH4产量（Lkg-1FOM）=（1.8A一l.1P+l.61B）×l000×22.4（4×v）

2Hr（%）=（4M+2P+2B）×100/（2A+P+4B）,其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。

.以上均为净摩尔数。

第二份取4ml瘤胃液样品加入等量的0.2mol/L的盐酸-20℃冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。

样品解冻后在4℃条件下15,000×g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度（Chaney,1962）"

第三份取7ml样品-20℃保存用于微生物蛋白的测定"室温解冻,取3ml混匀样品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000×g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100℃煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。

以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。

对原虫、产甲烷菌及细菌区系的影响

1材料与方法

1.1动物、试验设计及采样

同本章第一节。

1.2用于原虫PCR/DGGE分析的样品保存及引物比较

比较-20℃冷冻保存和液氮保存PCR/DGGE的样品效果及两对常用瘤胃原虫PCR/DGGE引物的筛选.

2.1实验动物和瘤胃内容物的收集

随机选取4只（A、B、C和D）装有永久性瘤胃瘩管的波尔山羊与本地山羊杂交后代,自由采食全粗料。

实验期间分别于饲喂前0h和饲喂后1、2、4和8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,4层纱布过滤,迅速投入液氮和-20℃保存以备瘤胃微生物基因组DNA的提取。

1.2.2瘤胃内容物总DNA的提取

参照Zoetendal等（1998）方法,将液氮和-20℃保存样品室温解冻,取解冻后混匀的瘤胃内容物样品1.smL,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯仿/异戊醇提取瘤胃内容物总DNA。

1.2.3PCR扩增反应

以瘤胃内容物总DNA为模板,两对原虫特异性引物进行比较,对原虫的185rRNA进行特异PCR扩增扩增"引物序列见表2-2。

1.3山羊瘤胃微生物基因组DNA提取

本章第一节所采集瘤胃液样品迅速保存在液氮中以备基因组DNA提取（DNA提取效果优于冷冻,见原虫DGGE方法优化部分）（Zoetendal等,1998）。

所提取基因组DNA用于原虫、细菌和产甲烷菌区系及微生物的定量分析。

1.4瘤胃微生物的DGGE引物

表2-2试验中使用的PCR引物

Table2-2Theprimersusedintheexperiment

使用特异的原虫、细菌和产甲烷菌DGGE引物（表2-2）扩增原虫18srDNA、细菌和产甲烷菌16srDNA。

使用Bio-RadDcode系统进行DGGE电泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝胶对原虫区系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝胶对细菌区系分析,6%的丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝胶对产甲烷菌区系分析。

先200V预电泳10min,然后85V电泳16h。

对DGGE胶进行银染（Muyzer,1993）。

DGGE胶上主要的和特异的条带用洁净的刀片和枪头切下移入。

1.5ml离心管中,37℃或室温过夜再进行PCR扩增,纯化PCR产物后测序,在GenBank上比对寻找最相似菌。

对山羊瘤胃微生物数量的影响

1材料与方法

1.1试验设计

本章第一节山羊在体试验不同时间点的DNA样品进行分析研究,以山羊瘤胃总细菌为参照,对瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相对数量进行定量分析。

1.2仪器设备!

试剂与耗材

实时定量PCR仪（ABI7300,美国）如图2-12。

实时定量PCR反应采用SYBRGreen染料法,荧光染料预混试剂为SYBRGreenRealtimePCRmasterMixwithROX（TOYOBO,Japan）。

实时定量PCR反应在八联管上进行（Axgen,USA）

表2-4定量PCR引物

Table2-4PCRPrimersforqPCRassay

1.3原虫计数

取瘤胃液与等量9%的甲醛溶液混合,于4℃保存用于原虫计数。

样品需进一步稀释以便于计数,原虫总数和五种原虫在显微镜下计数（Newbold,1987）。

为保证所有个体大小不同原虫都能被准确计数,对计数板进行了改装,使计数室高度增加为0.25mm。

1.4定量PCR反应体系与扩增条件

使用上述DNA样品对瘤胃微生物进行了定量分析（如总菌,真菌,产甲烷菌,黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌）,以上微生物的特异性引物见表2-4（Denman等,2006）。

使用荧光染料SYBRGreen进行标记,使用瘤胃微生物特异性引物,对微生物进行PCR扩增,根据定量PCR的循环数对微生物进行相对定量分析（ABI7300,USA）（Denman等,2006;Chen等,2008）。

使用ABI7300SDSversion2.0软件对数据进行分析,根据方程2-⊿⊿ct计算瘤胃产甲烷菌、真菌、黄化瘤胃球菌和产唬泊酸丝状杆菌相对于总菌的数量变化（Livak等,2001;Chen等,2008）。

实时定量PCR反应体系为20ul,反应体系组成见表2-5。

反应体系的配制在无菌超净台上进行,使用2ml灭菌的PCR管先配制反应体系母液。

而后使用清洁的移液器将母液分装到八联管中,每孔巧川,再加入己稀释5倍的DNA模板,设三个重复。

实时定量PCR的扩增条件见图2-13:

（l）95℃,10秒;

（2）95℃,30秒;60℃,1分钟;共40个循环;（3）熔解曲线分析扩增产物的特异性,温度以l℃/30s的速度从60℃上升到95℃。

实时定量PCR反应的熔解曲线见图2-14。

熔解曲线分析发现,扩增产物的熔解曲线具有明显的尖峰。

产甲烷菌的熔解曲线有双峰存在（图2-14A）,因为产甲烷菌有产甲烷杆菌和产甲烷球菌存在,使熔解曲线出现双峰,两个熔解曲线出现在84.5℃和88.8℃。

产玻拍酸丝状杆菌（图2-14B）、黄化瘤胃球菌（图2-14C）和瘤胃真菌（图2-14D）的熔解曲线为单峰,且位置单一,熔链温度分别出现在87.8℃、84.5℃和81.0℃附近,说明PCR扩增产物特异性高,不存在引物二聚体与非特异性扩增。

米曲霉培养物与蛋氨酸羟基类似物对奶牛瘤胃发酵和泌乳性能的影响_孙华

米曲霉培养物与蛋氧酸经基类似物对不同粗料底物瘤胃产气及发酵特性的影响

1材料与方法

1.1试验材料

米曲霉培养物（AOC）由BioZyme公司提供,产品名为Amaferm,Amaferm为黄色固体,含有的成分包括（DM为基础）:

DM为93.5%,CP为19.5%,NDF为52.4%,ADF为16.1%,灰分为7.8%,粗脂肪为3%;蛋氨酸经基类似物（HMB）为固态形式的蛋氧酸经基类似物钱盐,由NOVUS公司（诺伟司国际有限公司）提供,产品名为MFP,DM含量为99%,CP占85%,含有84%的蛋氛酸。

1.2试验设计

体外试验底物的精粗比为50:

50,其中精料为玉米,粗料分别为羊草（CWR）、苜蓿（AH）、青贮玉米（CS）和玉米梧（CST）之一,其营养成分组成见表2-1。

每一培养底物均按照2×3因子设计分配试验处理,生产中AOC每头牛每天的添加量为5-l0g,而HMB的添加量为25g,瘤胃体积按照50L计算,因此对应30mL的痛胃培养液,因此体外分别添加AOC（0、3、6mg）和HMB（0、15mg）,每个处理有3个重复。

1.3瘤胃液供体动物及饲养

4头装有永久性瘤胃瘦管的奶牛（泌礼天数为213土6.5）作为瘤胃液供体动物,词嘱日粮精粗比为55:

45,词料配方见表2-2,日词嘱3次,自由饮水。

1.4产气试验程序

采用Menke和Steigass（1988）的Syringe系统（100mL注射器）,进行人工瘤胃体外产气试验,如图2-1所示。

人工唾液的配制按Menke和Steingass等（1988）方法进行,配方如下:

在520.2mL蒸馏水中依次加入208.1mL缓冲落液（B）、208.1mL常量元素溶液（C）、0.1mL微量元素溶液（A）、l.0mL刃天青指示剂_（D）,62.4mL还原刻溶液（E）,通入CO:

厌氧使其饱和,直至溶液由淡蓝色转变为无色。

每个体外装置中底物添加量为200mgDM（精粗比为50:

50,精料为玉米,粗料分别为羊草、苜着、青贮玉米和玉米秸之一）,同时分别设置一个空白对照组（不添加底物、AOC和HMB）和一个标准羊草组。

试验当天在奶牛晨饲前抽取3只瘘管牛的瘤胃液,4层纱布过滤到提前预热的收集瓶中,于39°C水浴中保温,并同时通入CO2保持厌氧状态,待用。

人工唾液按Menke方法（1988）配置,将人工唾液与瘤胃液按照2:

1的体积比例混合均勻,然后用三通管准确吸取CO2饱和的瘤胃混合培养液30mL移入每个培养管中,摇晃培养管使底物和瘤胃液混合后,排出气泡,加上夹子,读数,然后将其置于39°C的水浴摇床中进行体外发酵培养。

在同样条件下重复上述体外产气试验1次,两次标准羊草产气量相对偏差小于10%即可,若相差太大,应考虑重做。

培养的3、6、9、12和24h记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管,旋动管塞后读数,以管塞刻度的中部为准）。

1.5测定指标及方法

读取培养管的刻度,以计算产气量、潜在产气量、产气速率和有机物消化率。

培养24h终止后,立即测定发酵液pH;取体外发酵瘤胃液上清液1mL,加入0.2ml8.2%偏碟酸,4°C保存测定挥发性脂肪酸（VFA）的浓度;取瘤胃混合液,采用比色法测定氨态氮（NH3-N）浓度、嚷呤法测定微生物蛋白（MCP）产量。

1.5.1产气量

GPt=200×（Vt-Vo）/W

式中,GPt为样品在t时刻的产气量（mL）;Vt为样品发酵th后,培养管刻度读数;Vg为样品在开始培养时,培养对应的刻度读数;W为样品干物质重量（mg）。

1.5.2产气参数

利用fitcurve软件（MLP;LawesAgriculturalTrust,1991）,根据Orskov和McDonald（1979）的产气模型公式将各样品在3、6、9、12、24h时间点的产气量代入,计算消化动力参数。

模型公式为:

GP=a+b（l-exp-ct）,其中GP是t时间的产气量,a为快速产气部分,b为缓慢产气部分,C为b的产气速度常数,a+b为潜在产气量。

1.5.3体外有机物消化率（IVOMD）

根据Menke和Steingass（1988）提出的公式计算体外有机物消化率,

IVOMD（%）=0.986GP+0.0606CP+11.03其中GP为24h产气量（mL/200mg）,CP为粗蛋白含量（g/kg）。

1.5.4pH值

使用S40Mutimin型pH计测定样品pH值。

1.5.5挥发性脂肪酸

取混合好的瘤胃液样品,于4℃、20000g离心l0min,取离心后的上清液加入专用的气相小瓶,用气象色谱仪测定瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的含量。

测定条件:

柱温180℃,气化室温度200℃,检测室温度220℃,载气使用高纯氮气,总压力90kpa,总流量37.2mL/min,柱流量0.67mL/min,线速度23.4cm/sec,分流比50,吹扫流量3mL/min,循环流量8mL/min,氧气流量40mL/min,空气流量400mL/min。

1.5.6氛态氣浓度

采用比色法测定瘤胃液样品的氨态氮浓度（胡伟莲,2005）,并进行了适当的修改。

①以0.2M盐酸溶解0.382g氯化铵,定容至l00mL,作为保存液,4°C保存。

②用蒸馏水将l0mL保存液稀释定容至l00mL,为工作液,含氮量l0mg/l00mL。

③取工作液0、1、2、4、6rnL分别置于50mL容量瓶内,依次加入蒸馏水10、9、8、6、4mL,再用0.2M盐酸定容。

成为每l00mL含氮量0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。

④取标准系列溶液0.lmL分置于2mL离心管内,各管中依次加入亚硝基铁氰化纳水杨酸纳溶液0.5mL和次氯酸纳氢氧化纳溶液0.5mL,摇勻、静置l0min后,用Eppendorf枪吸取200ul混合液用SpectraMaxM5酶标仪比色。

波长700nm,用不含氮的0号管液作空白对照。

记录各吸光值。

⑤用吸光值作自变量,溶液含氮量作从变量导出回归方程式。

⑥样品测定:

取ImL瘤胃液在4000rpm离心l0min,量取0.lmL上清液和0.5mL蒸饱水置于5mL离心管内,再加入2.4mL0.2M盐酸,稀释上清液30倍,摇勻。

比色操作同④。

把测得的吸光值代入回归方程式,计算样品中的氨氮含量。

1.5.7微生物蛋白产量

采用噪呤法测定微生物蛋白产量（胡伟莲,2005）。

A.酵母RNA标准曲线的制作。

①分别称取5、15、25、35、45和55mg酵母RNA于l0mL离心管中,加入2mL0.6MHC104,95°C水浴1h,冷却。

②分别加入6mL28.5mM的NH4H2PO4溶液,95°C水浴15min,冷却后在3000g,4°C条件下离心l0min。

③取0.8mL上清夜,向上清夜中加入3mL0.2M的NH4H2PO4溶液,并用12.5ul的85%磷酸调整溶液pH至2-3。

④取调整pH值后的溶液3.8mL,向其中加入0.2mL0.4M的AgNO3溶液,混合后于4℃避光过夜。

⑤过夜后于3000g,4℃条件下离心l0min,弃上清液;用4.5mLpH=2的蒸德水冲洗沉淀;再于3000g,4℃条件下离心l0min,弃上清液。

⑥向沉淀中加入5mL0.5M的HC1溶液,混匀,95°C水浴30min后,以3000g离心10min;

⑦上清液用0.5MHC1稀释40倍后,以0.5MHC1溶液作参比,在260nm下用DU800分光光度计比色,根据光密度值作出标准曲线。

B.样品微生物蛋白浓度的测定。

①取8mL瘤胃液于3个l0mL离心管中,在20000g,4℃条件下离心20min;弃上清液后加入2.104niL0.6MHC104,于95°C水浴1h,冷却。

②按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作。

③以0.5MHC1溶液作参比,在260nm下比色,根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值。

④根据以下公式计算微生物蛋白氮产量:

微生物蛋白氮（mg/mL）=RNA测定值（mg/mL）×RNA含気量/细菌氮中RNA含氣量×稀释倍数

其中,RNA含氮量为17.83%,细菌氮中RNA含氮量为10%。

微生物蛋白（MCP,mg/mL）=微生物蛋白氮（mg/mL）×6.25

米曲霉培养物与蛋氨酸幾基类似物对不同粗料底物瘤胃微生物及其酶活的影响

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料为本章第一节体外培养24h后终止发酵的混合培养物。

1.2测定项目及方法

1.2.1微生物酶活

1.2.1.1试剂

（1）0.2mol/L碟酸缓冲溶液（pH=6）

a,称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）71.64g,用蒸饱水溶解,并定容至1000ml;b.称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）31.21g,用蒸馏水溶解,并定容至1000ml。

取a液123ml,加b液877ml混合均勻,配制成1000ml0.2mol/L磷酸缓冲溶液,用pH计校正至pH为6.0备用。

（2）0.5%羧甲基纤维素纳（CMC）（Sigma-C9481）溶液0.5g的CMC悬浮于80ml缓冲液中,且在微热（60度）和揽拌的情况下,直至完全溶解,最终用缓冲液定容至l00ml。

（3）0.5%微晶纤维素（Sigma-MKBB4236）

准确称取0.5g微晶纤维素加至100ml缓冲液中,60℃水浴揽拌溶解后,4°C保存备用。

（4）0.5%木聚糖（Sigma-X4252）

加热揽拌器上加热大约60ml缓冲液到60度;慢慢加入0.5g木聚糖,加热煮沸同时揽拌,不断搅拌下过夜冷却,添加蒸饱水定容至100ml。

（5）0.5%可溶淀粉（Sigma-S4126）

称取0.5g淀粉,用水调成浆状物,在拔动下缓缓加入70ml缓冲液中,然后,以30ml缓冲液分几次冲洗装淀粉的烧杯,洗液并入其中,加热至完全透明,冷却,定容至l00ml。

此溶液需要当天配制。

（6）3,5-二销基水杨酸（DNS）试剂称取DNS3.15g,加水500ml,拔拌5s,水浴至45°C,然后逐步加入100ml氢氧化纳溶液,同时不断揽拌,直到溶液清澈透明（注意:

在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48°C）。

再逐步加入四水酒石酸钾纳91.0g、苯酸2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。

继续45°C水浴加热,同时补充加水300ml,不断揽拌,直到加入的物质完全溶解。

停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml。

用烧结玻璃功率器过滤,取滤液,於存在棕色瓶中,避光保存。

室温下存放7d后可以使用,有效期为6个月（张顺英,2007）。

（7）葡萄糖、木糖标准溶液

称取1g无水葡萄糖（105°C）,用缓冲液溶解并定容至l00ml,4°C避光保存3天内使用,或在-20°C长期保存。

1.2.2.2测定步骤

（1）葡萄糖（Sigma-G6152）标准曲线制作

①将葡萄糖原液（l0mg/ml）配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7mg/ml的葡萄糖标准液。

②取24个2ml的离心管,其中21支试验管3支空白对照管,编号后依次加入0.4ml对应的葡萄糖标准液,向各管中加入0.2rnl磷酸缓冲液,然后各管加入0.8rnlDNS溶液,摇匀后沸水浴5min,取出后用流水冲洗冷却,540nm波长下比色,以空白为基础,以净吸光度为横坐标,葡萄糖量（mg）为纵坐标,制备标准曲线,得出回归方程。

（2）木糖（Sigma-X3877）标准曲线制作步骤同葡萄糖标准曲线的制作,