CLSI临床质谱新统一标准解读.docx

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CLSI临床质谱新统一标准解读

CLSI临床质谱原则

C62-A新内容解读

CLSI临床质谱原则C62-A主题内容架构由基本内容某些涉及

（1）范畴、

（2）原则防止办法、（3）术语、（4）仪器；办法内容涉及（5）预考察事项、（6）办法建立、（7）办法验证；质控内容涉及（8）液质检查办法质量保证与质量控制、（9）后续监督构成。

其中办法和质控内容是与应用过程直接有关。

下面进行详细简介。

5．预考察事项（preexaminationconsiderations）

5.1目的分析物

内容涉及5.1.1外源性物质、5.1.2内源性物质、5.1.3外源性和内源性物质有关因素、5.1.4样本采集。

要充分理解目的分析物性质，包括

（1）目的分析物临床意义如生理意义、临床价值、惯用检测办法等；

（2）理化性质如构造式、分子量、沸点、极性大小、酸碱性等；（3）存在形式如游离型、结合型；（4）干扰因素如类似物、同分异构体、其她代谢产物等；（5）预期浓度如常量级、微量级、参照区间浓度、切点浓度、病理浓度等；（6）样本类型如血清、血浆、全血、尿样、唾液、胆汁、组织等；（7）采集和解决方式如静脉血、足底血、指尖血、离心解决或静置、何种采血管等；（8）储存和运送方式如避光、冷藏、冷冻等。

5.2内标

内标可以校正基质效应或者样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生偏差，有助于提高定量分析精确性和精密度及办法稳定性。

5.3试剂和耗材质量

5.3.1试剂盒耗材质量：

由于MS敏捷度高，因而试剂和耗材规定也高。

在使用前应对试剂、耗材进行验证，避免其中杂质对MS影响。

使用过程中应按照SOP进行保存、操作，避免污染。

按照ISO17025:

进行批间次管控。

5.3.2实验室设备：

配备校准品和内标时，实验室应使用A级容量瓶和移液器。

6．办法建立（assaydevelopment）

6.1离子转变（iontransition）

在建立和优化质谱采集参数过程中，要先配制原则物质溶液直接导入质谱检测器进行质谱扫描，获取目的化合物有关信息。

依照目的分析物极性选取适当离子化方式：

ESI源适合中档偏大极性化合物、难挥发化合物或热不稳定化合物；APCI源适合有一定挥发性中档极性或低极性小分子化合物。

依照化合物功能基团选取正负离子模式，然后选取适当离子对分别作为定量离子对和定性离子对。

之后，优化化合物参数，涉及离子源参数以及质谱扫描参数，使所选取离子对质谱响应值最高。

6.2高效液相色谱固定相

色谱柱种类繁杂，色谱柱选取普通取决于目的分析物元素构成和化学构造。

弱极性固定相有C18、C8、苯基柱等，极性固定相有氨基柱、氰基柱、硅胶柱等。

要注意色谱柱耐压范畴和pH使用范畴。

当更换色谱组时，应使用系统合用性样本（SSS）进行核查。

6.3高效液相色谱流动相

流动相设计取决于目的分析物理化性质和色谱柱特性。

影响分离效果流动相参数涉及溶剂构成和比例、流速、离子强度、pH值、添加剂和温度等。

其中避免使用添加剂有非挥发盐、无机盐（腐蚀离子源）、表面活性剂（抑制电喷雾）、离子对试剂（影响后续离子化）。

进行梯度洗脱或等度洗脱时，要注意溶剂比例、进样量、运营时间、梯度范畴、柱温、样品溶剂等因素对分析成果影响。

应明确标注流动相有效期。

6.4参数考察（examinationvariables）

6.4.1保存时间

控制流动相、色谱柱及外部条件（如温度）等。

要预混合、防蒸发、控制pH值、保证泵流速。

规定每次检测保存时间变化在±2.5%内。

6.4.2色谱辨别率

应达到基线分离Rs>1.25。

可以通过增长色谱柱长度、变化流动相构成和比例、减缓梯度、减少流速和提高柱温来实现良好色谱分离。

6.4.3其她改进色谱质量因素如使用保护柱、减少死体积、检查管线连接到位等。

6.4.4信噪比

LLMI处S/N至少不不大于10，建议不不大于20。

改进S/N办法有考察基质效应、再优化提取效率、离子源参数、洗脱梯度、重组溶液、进样体积，优化驻留时间，优化进样量，优化前解决以及考虑衍生。

6.4.5色谱峰数据点和积分

推荐15-20个数据点，定量项目最低不少于10个数据点进行拟合。

采集数据点个数应与驻留时间关于。

采用正切斜滑（tangentskim）方式积分非基线分离色谱峰。

6.5误差来源

6.5.1由基质效应引起

生物样本高度复杂，基质构成普通涉及盐类、脂类、蛋白、多肽有机小分子等。

盐类、脂类（特别是磷脂）是离子化效率最重要影响因素。

多数基质干扰可以通过样品前解决或色谱分拜别除。

6.5.2碎片离子交叉干扰

如果两个碎片离子有相似m/z，并且同步进入碰撞室也许会发生干扰。

新筛等项目需要同步采集多离子通道信号时也也许会发生碎片离子干扰。

驻留时间和切换通道时间极端（<1ms）时也易浮现碎片离子交叉干扰。

6.5.3内调和校准品杂质

6.6办法校准（assaycalibration）

6.6.1概述

6.6.2校准物质

建议实验室购买和使用商品化原则品，如无法获得商品化原则品则可以自配。

校准物质应具备拟定纯度和稳定性信息。

只要也许，校准物质定值应溯源至参照办法（ISO17511）。

推荐使用有证原则物质（CRMs），但是可供当前使用CRMs较少。

不推荐使用无基质溶剂配制校准品，除非证明该操作不会引起基质效应。

CRMs可用于验证商业校准品或实验室自配校准品定值，但是应注意基质效应。

用于配制校准品基质要尽量与临床样本相似。

对于外源性分析物，不含分析物生物体液可作为抱负基质。

对于内源性分析物，推荐使用“模仿”基质减少基质效应，经透析、活性炭解决临床样本可作为“模仿”基质。

若解决后分析物残留仍>20%LLMI则可使用人工合成基质。

实际样本难以除去内源性待测物时也可使用溶液基质校准品。

上述均应注意考虑基质效应。

总结来说就是校准品原材料“级别”越高越好。

配制用基质与临床样本越相似越好。

要时刻注意考察基质效应。

6.6.3校准品数量和位置

FDA规定校准应涉及空白、零点、6-8个浓度点（建立原则曲线）。

在实际操作中，原则品浓度点应定位于LLMI和ULMI，以及分析范畴内所有有关医学决定水平点。

弱原则曲线范畴跨度超过3个数量级（如10-1000），或范畴内存在非线性区间，建议增长原则品数量或者缩小浓度检测范畴。

建议在每个检测批次前运营原则曲线。

或实验定标频率能保证检测质量，则可视详细状况而定。

6.6.4生成曲线

6.7预验证（preverification）—评估基本性能参数

6.7.1选取性和特异性

第一步：

进行背景噪音评价。

双空白样本（无目的分析物/无内标）反映LC/MS系统整体背景噪音。

应满足如下规定之一：

无背景峰、背景峰面积不大于LLMI处分析物峰面积20%、不大于等于预期保存时间处IS峰面积5%。

6.7.2基质效应评估

基质效应是指在样本测试过程中，由于目的分析物以外其她物质存在，直接或间接影响目的分析物响应现象。

C62~专指对质谱系统基质效应；互通性评价~普通指常规办法基质效应。

基质效应也许会对分析产生普通性或样本特异性影响，引起敏捷度和回收率损失，引入误差，是对LC-MS办法验证重要一环。

推荐办法为提取添加实验—前解决为液液萃取、蛋白沉淀等。

其中set1具有待测物+内标+流动相，set2具有待测物+内标+提取后基质，set3具有待测物+内标+未提取基质（样本）。

对比set2/set1可以评估基质效应，对比set3/set2可以评估提取效率，对比set3/set1可以评估前解决回收率。

提取添加实验设计和成果计算应制备5条不同原则曲线（基质实验应做5批，计算成果平均值），每批包括5种不同基质（样本）。

结合Tea考虑，如果精密度>15%，需要重新优化办法，如果在一种样品基质中自办法敏捷度和特异性不能满足规定，需要重新优化办法。

尚有柱后灌注实验可直观评估基质效应。

基质混合实验（CLSIEP-07）办法：

混合具有目的分析物不同机制样本（普通为纯溶液样本和生物基质样本）分别解决后进样分析，比较混合液样本响应值与生物基质样本和纯溶液样本响应值均值，评估基质效应与否存在和影响目的分析物准拟定量。

当基质效应评价成果不抱负时，可以使用同位素内标进行补偿和抵消。

还可以减少进样量，稀释样品，减少流速。

还可以优化样本前解决，优化流动相条件使目的分析物出峰时间错开发生离子抑制时段，更换添加剂如TFA，更换色谱柱，更换离子化办法如ESI换APCI，或者尝试使用其她型号品牌质谱系统。

6.7.3交叉污染（携带污染）

LC-MS是由持续流路构成，这种一体化检测系统会增长高浓度样本残留风险。

当前，尚无临床指南设定LC-MS容许残留原则，但携带污染不应对检测精确性或精密度产生明显影响。

无论同一次运营其她样本中分析物浓度如何，分析空白样品时检测器信号都应当远低于LLMI（如25%）。

评级办法参见CLSIEP-10或FDA指南。

如果携带污染不不大于规定原则，建议减少进样量并减少最高原则曲线浓度。

对未知样本在浓度高于最高原则曲线浓度样本之后进样成果需要重新分析。

交叉污染重要在自动进样器。

管路、进样针、分析柱和流路连接处产生。

浮现交叉污染时可以重新设立进样程序，洗针程序，调节梯度洗脱程序，流动相构成。

必要时，使用前钝化色谱柱。

6.7.4初步精密度（重复性）评价

在进行全面（多批次）办法验证之间进行初步精密度评价。

选取三个浓度点：

110%LLMI，90%ULMI，（LLMI+ULMI）/2。

一批进行20次重复测定。

计算SD，CV和靶值回收率。

如果不满足预设原则，则要重新优化办法。

在正式用于临床检测前，任何一种质谱办法都需要进行办法学验证。

目就是验证办法可靠性。

如果办法性能发生明显变化则规定办法重新优化并重复办法学验证，其中涉及LOD，LLMI，线性和稀释，精密度，精确度，干扰。

7办法建立（assaydevelopment）

7.1检测限和定量检测下限

7.1.1LOD

LOD检测限是指检测办法在规定实验条件下所能检出分析物最低浓度。

仅用于辅助拟定检测办法LLMI。

可参照CLSIEP17。

7.1.2LLMI

LLMI定量下限是在满足实验室对精确性和精密度规定前提下，检测办法在规定实验条件下所能准拟定量检测分析物最低浓度或最低量。

采用LC-MS定量检测时不建议报告低于LLMI检测成果。

7.2线性与稀释

线性验证明验办法参见CLSIEP-06。

推荐9-11点浓度，2-4次重复。

避免逐级稀释（引入系统误差）。

采用多元回归方程（如加权最小二乘法）评价线性，记录线性方程和有关系数。

进行稀释时，最佳使用不含分析物天然基质作为稀释基质。

稀释过程需要验证，基本接受原则为回收率/对的率±15%，精密度≤15%。

会有三种稀释状况：

（1）定量范畴以内稀释如需要改进离子抑制或增强，

（2）定量范畴以外稀释如当分析物浓度不不大于ULMI时应进行稀释，此时要注意是对提取物进行稀释，稀释终浓度至少不不大于3倍LLMI，同步要注意IS浓度变化。

（3）小体积样本稀释。

小体积样本（如婴幼儿普通只能采到15~50μL血清）也许需要稀释以达到最小分析体积规定，此时需要对原样本进行稀释，注意稀释基质，要考虑不同病理生理状态，稀释终浓度至少不不大于3倍LLMI，如无法达到，应有质控办法（相似水平质控）。

7.3精密度

基本过程参见CLSIEP-05，CLSIEP-15。

用于评估办法重复性（批内）和再现性（批间）。

精密度评价是整个测定过程，涉及样本采集、保存、样本前解决、质谱检测等。

平进行精密度评价样本应当性质稳定，临床样本为佳，浓度在定量范畴内及医学决定水平±25%。

不满足浓度规定期可以稀释或添加，但要注意基质效应。

要与临床应用密切结合，考虑实际使用状况。

普通规定CV≤15%，LLMICV不大于等于20%。

兼顾考虑Tea，建议不超过TEa/3。

同步兼顾考虑生物学变异，临床指南文献，地方原则等。

7.4检测干扰

基本过程参见CLSIEP-07。

LC-MS仍可受到各种物质干扰，如药物及其代谢物质、补充剂、样本基质和性状、抗凝剂、促凝剂等，针对目的人群，对已知和潜在干扰进行考察。

关注同分异构体或同位素干扰（办法建立难点之一）。

在办法建立时，推荐使用含高浓度干扰物临床样本进行干扰评估（CLSIEP-07）。

在寻常工作中，要积累检测办法建立和验证阶段数据，以及目的人群样本可接受范畴。

监测定量、定性离子通道丰度比，监测峰型、保存时间、分析与内标相对关系一致性。

7.5对的度（trueness）

检查办法核心三要素是校准品浓度精确性、溯源性、测量不拟定度。

对的度验证有三种办法：

办法间比对、分析具备赋值物质、回收实验（多重）。

使用样本优先顺序为实际病人样本>混合病人样本>血清基质QC>水溶非生物溶液。

依照生物学变异、临床指引原则及本地法规规定拟定接受原则。

进行办法间比对时，最具备说服力方案是与参照办法比对，选取不不大于40个目的人群病人样本，覆盖AMI。

除此之外，也可与常规方比对，其成果仅阐明差别限度（difference），不能表达偏倚（bias）。

此为老式方案，可以用于参照区间转化，但是存在免疫法与质谱法成果有关性不佳，这与免疫法特异性问题关于。

当分析具备赋值物质时，可以通过具备参照办法定值有证参照物质或者可接受代替品评估对的度。

测定有证原则物质，来源为NIST，JCTLM列表，参照办法定值PT材料。

需要验证3~5批，每批重复2次。

当参照物质与参照办法均无法获得时，可进行加样回收实验。

可在购买参照物质与参照办法比对之迈进行（预判）。

进行过程中，添加已知量原则品至指控样本或病人样本中，3个浓度水平，至少5个重复。

8液质检查办法质量保证与质量控制

LC-MS实验室质量管理体系核心要素是质量保证（QA）和质量控制（QC）。

QA规定监测从样本采集、成果检测、成果报告到报告解释全过程。

QC是LC-MS检测办法运营期间性能评价，旨在保证其能满足预期医学用途。

QC样品应与样本通过相似前解决过程，使用相似检测办法。

8.1质控物选取

8.1.1质控品基质选取

应选取适当基质，尽量与病人样本一致，也可选用商品化材料或自配。

无论选用哪种基质，必要考虑基质与病人样本接近限度（脂类、蛋白、药物、透析）、批间和批内均匀性、校准品和质控品分别独立制备。

8.1.2质控品稳定性评价

质控品稳定性评价是质控品有效应用基本前提，要考察短期、长期和冻融稳定性。

8.2质控品浓度和频率

8.2.1浓度

要尽量覆盖定量范畴。

推荐至少三个浓度点：

3倍LLMI，定量范畴中间以及ULMI附近。

在LLMI或者医学决定水平附近设立浓度有助于初期发现失控。

8.2.2最小频率

动态管理质控频率取决于办法学性能，某一时间段内检测样本数量以及错误成果对于临床影响严重限度。

如果办法很稳定可以减少质控频率。

反之，如果办法存在性能下降状况，需要增长质控频率。

推荐每批次>5%样本总数，至少6个质控品（3浓度*2次重复测定）置于分析批前、中、后。

最低规定24小时2个质控。

8.3其她QA/QC样本

8.3.1系统合用性测试

样本类型为非提取样本，普通为分析物或内标纯溶剂溶液。

测定办法至少重复3次，弃去第一次成果。

推荐重复7次（参加9.2.1）。

检测参数有噪音、分析物信号、保存时间、色谱峰分离度和色谱峰对称性。

推荐至少在每个分析批次之前、防止性维护之后、仪器卸真空后或者当系统平衡浮现问题时就行系统合用性测试，以保证检测系统处在正常状态。

8.3.2双空白和单空白

双空白：

在采集离子通道上无峰或峰面积<20%LLMI。

单空白：

只具有IS，考察降解IS对分析物峰面积影响，规定<20%LLMI。

8.4指控可接受原则评估

实验室因依照质量目的和临床应用建立本室可接受原则。

对于商品化质控样本，生产商提供可接受原则使用前应进行验证。

8.5失控时纠正办法

所有失控和纠正办法均应记录。

要监控涉及数据类和图形类参数。

8.6多项目、多重检测质控方略

每个分析物分别设定质控参数。

重要考虑分析物之间关联性。

8.7周期性质控程序（参照ISO17025）

至少要每6个月校正一次或按厂家推荐进行质谱质量校准/调谐，普通每3个月做一次PPG调谐。

实验室同步配备各种LC/MS系统时，至少每6个月检查一次各系统间有关性。

换新色谱柱时前言进行验证。

QC、校准品、试剂、流动相批次更换，实验室可视状况自行拟定验证程序。

周期性对的度验证，测定参照物质，推荐每半年一次或参加对的度验证筹划。

8.8其她质量保证因素

对样本进行追踪。

对每一份样本贴上带有可追踪信息及编码标签，与记录相应。

9实行后监测

9.1能力验证

参加EQA筹划，评价实验室检测能力，对能力比对成果进行分析总结，关注比对成果与否产生趋势或偏倚。

对于无EQA筹划提供检测项目，与外部实验室相似或相近办法比对，需要考虑两种办法检测性能，涉及样本可接受范畴和定量检测限等。

9.2系统性能监测

系统适应性样品（SSS）应为非提取样品，不经前解决，直接进行检测。

推荐7个点、5个高浓度（CV<6%）+1个空白（<20%LLMI）+1个LLMI（S/N>10），分析批前、仪器维护后、断电、失真空、调谐后均要进行系统适应性检测。

样品保存时间应为原则品±2.5%，要对校准品和内标信号进行监控，校准曲线、斜率监控R2≥0.995，同步对离子信号比值进行监控。