模块法构建多级骨组织和新型水凝胶修复软骨缺损的研究.docx

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模块法构建多级骨组织和新型水凝胶修复软骨缺损的研究

模块法构建多级骨组织和新型水凝胶修复软骨缺损的研究

研究背景：

严重创伤、骨肿瘤的切除造成的骨或软骨缺损是临床常见的外科疾病。

局部大量或节段性骨缺损造成骨骼力学支撑功能丧失,继而严重影响患者的正常生活。

软骨的缺损会导致关节功能下降,同样会严重影响患者的生活质量。

目前常用的自体骨、软骨移植,异体骨移植以及骨材料填充,和软骨外科技术修复,都各有优缺点,不能真正满足临床实际的要求。

如何更好地修复骨缺损和软骨缺损一直是外科领域,生物材料领域,组织工程领域专家关注的热点。

本研究主要围绕骨,软骨的组织工程修复来开展,针对骨,软骨领域中不同的问题采用了不同的解决策略。

在利用骨组织工程构建移植体时,必须充分考虑移植体的多级结构和血管化的问题才能实现模拟天然骨结构的目的。

传统骨组织工程主要包括支架材料、种子细胞和生物信号分子（生长因子等）。

研究主要从优化支架材料的设计,添加使用促进骨修复的生长因子等角度来尝试解决上述问题。

但目前这两类措施都未能实现构建有效的血管系统,也无法对骨组织的多级结构和血管化进行调控。

因此如何能够实现与骨结构层级关系对应的修复效果,实现血管化,在结构和功能上达到一致,还急需创新组织工程研究方法。

近年来随着纳米材料的发展,和微纳米加工技术在组织工程中的应用,逐渐兴起bottom-up组织工程有望解决上述问题。

bottom-up组织工程构建策略是,模块法,即通过在微观尺寸上进行结构设计,制备出可模拟天然结构的模块,以此类模块来集合重建较大体积的组织。

根据bottom-up的构建方法,可实现对构建的目的组织在细胞层面进行时间和空间上的控制。

目前在bottom-up组织工程中利用到的模块多是微米级的水凝胶块,微球等。

近年来出现了以纳米纤维材料为主的模块,充分利用微/纳米结构的组合来实现对细胞的调控和多级组装。

纳米纤维就是一种可以模拟细胞外基质的,具有微纳米结构的生物材料。

目前有很多种由静电纺丝制备的纳米纤维作为组织工程的支架材料。

通过对纳米纤维进行加工修饰,制备成功能化模块,在结合微加工技术进而可组装成一个大体积的骨组织。

在软骨修复过程中,应用非侵入性方法将干细胞及活性分子置入于软骨缺损是非常实用和有效的。

可注射性水凝胶,因为其能形成各种不同形状而适用于各种不规则软骨缺损,可以将各种需要成份移植于需要部位,而不需要开放手术。

水凝胶能包裹细胞,可维持细胞原始的圆形形状,具有一定的粘弹性可传递生物机械负荷,拥有孔隙结构,有利于营养及废弃物的转运。

因此本研究第二部分重点在开发新型水凝胶以促进软骨修复,我们重点研究了如何改进海藻酸以提高对海藻酸结构保护,充分挖掘其在软骨修复中的应用。

全文分为2个部分,第一部分：

制造三种模块和多级组装构建骨组织；第二部分改性海藻酸-壳聚糖水凝胶修复软骨缺损。

研究内容第一部分一、成骨模块目的：

利用复合纳米羟基磷灰石的PCL/gelatin纳米纤维,模拟骨骼中的矿化胶原纤维,制备成骨性模块。

材料与方法：

静电纺丝法制备nHA/PCL/gelatin纳米纤维：

称取PCL和明胶各1g分别加至10ml三氟乙醇中进行磁力搅拌4h,取PCL和明胶溶液各5ml混合后继续搅拌2h。

将500mgnHA混合入lml2%F-127溶液中超声促分散,再按比例将纳米羟基磷灰石加入到聚合物溶液中,得到nHA占聚合物的比例为10wt%,20wt%,40wt%,得到三种混合液。

将混合液加至注射器中,安装至推注器上,调整速度为lml/h,电压为15kv,采用不锈钢框接收,接收距离为15cm。

接收时间为1h。

nHA/PCL/gelatin纳米纤维的物理表征利用SEM,TEM,XRD,TGA对nHA/PCL/gelatin纳米纤维进行有关物理性能表征。

nHA/PCL/gelatin纳米纤维的生物相容性检测和成骨诱导培养检测取SD大鼠原代脂肪干细胞培养,待细胞扩增至第三代应用于实验。

按5×103/cm2把ADSCs种植到纤维膜上,在24h后和第3天后进行live/dead染色,分析细胞存活情况。

取24h后和第3天样品,2.5%戊二醛固定,制备电镜观察样品,SEM分析细胞在纤维膜表面生长形态。

加入成骨诱导液,诱导14天后,进行茜素红染色；OCN和RUNX2免疫荧光检测,分析阳性细胞率,以单纯培养第3天样品为对照组进行统计分析。

结果：

nHA/PCL/gelatin纳米纤维物理特性根据SEM分析,在加入nHA后,随着浓度的升高,对纳米纤维膜表面有一定程度的影响。

在10wt%,20wt%的比例时候,膜表面平整,纤维随机分布,孔隙均匀,适合作为支架材料,在加入到40%后,纤维结构出现不规则球状,纤维分布不均匀。

TEM观察,10wt%,20wt%的nHA均包含在纤维内部,散在分布,40wt%时,出现聚集,对纤维形态产生影响。

分析XRD,在复合纳米纤维中检测出nHA的晶体结构峰值,且晶体结构完整,静电纺丝过程对纳米羟基磷灰石的结构影响不大。

热重分析各个比例复合纳米纤维发现,纺丝中nHA含量与设计基本一致。

综合物理表征,我们选择20wt%的nHA/PCL/gelatin纳米纤维进行下一步研究。

nHA/PCL/gelatin纳米纤维的生物学特性本研究采用大鼠脂肪干细胞作为种子细胞,在种植后24h,第3天后live/dead染色发现,细胞在膜上存活状态良好,染成红色的死细胞比例低于5%,第三天细胞数量较第一天明显增多,说明细胞增殖状况良好。

电镜扫描分析,在种植后的24h,和第3天发现细胞与纳米纤维粘附紧密,细胞逐渐从梭形铺展开来,在诱导14天后可成片的细胞,并观察到大量钙结节出现。

茜素红染色在对比种植第3天和诱导第14天发现,脂肪干细胞细胞分化为成骨细胞效果明显,结合OCN和RUNX2的免疫荧光,诱导第14天的阳性细胞率显著高于种植第3天的阳性细胞率（p<0.05）。

结论：

本研究通过物理性能表征和生物学检测,证明含20wt%的nHA的复合纳米纤维可做为成骨诱导的支架材料,结合纳米纤维的微纳米结构,是作为bottom-up组织工程的结构单元构建多级骨组织的理想材料。

二、血管模块目的：

制备血管模块,利用材料的纳米拓扑结构,聚多巴胺和血小板共同诱导脂肪干细胞分化为内皮细胞。

材料与方法：

称取PCL和明胶各1g加至10ml三氟乙醇溶液中进行磁力搅拌4h,取PCL和明胶溶液各5ml混合后继续搅拌2h。

将混合液加至注射器中,安装至推注器上,调整推注速度为1ml/h,电压为15kv,采用高速取向器接收,接收距离为15cm。

接收时间为30min。

将接受的静电纺丝,置于戊二醛蒸汽下交联1h。

配制2mg/ml多巴胺溶液：

称取200mg多巴胺,溶于100mlpH=8.5的50mMTris-HCL缓冲液中。

将制备的纳米纤维膜浸入至多巴胺溶液中,过夜,取出纤维膜采用超纯水清洗表面多次,氮气干燥备用。

取SD大鼠全血,两次离心法制备血小板,用DMEM稀释后,将膜浸入到含血小板的DMEM中,37℃C2h后,取出样品采用DMEM洗三次,去掉未粘附的血小板。

准备第三代大鼠脂肪干细胞,以5×103/cm2种植到纤维膜上,共分4组膜来种植细胞分别为1）PCL/gelatin纳米纤维膜,2）PCL/gelatin纳米纤维膜+血小板,3）PCL/gelatin纳米纤维膜+多巴胺+血小板,4）PCL/gelatin纳米纤维膜（加EGM-2内皮细胞培养基）,前三组加入普通培养基,第四组为阳性对照加入内皮细胞培养基。

纳米纤维膜的物理表征对纤维膜的表面形貌,纤维的走向,多巴胺的粘附,血小板的粘附进行SEM表征。

对纤维膜多巴胺修饰前后的亲水性采用静态接触角进行表征。

生物相容性和内皮分化鉴定采用live/dead染色分析细胞的存活情况,采用免疫荧光染色检测内皮细胞特异性标志物CD31和vWF的表达。

结果：

根据SEM结果分析,静电纺丝采用高速取向器可得到平行排列的纳米纤维,纤维结构均匀,间隙匀称。

进行多巴胺修饰后高倍扫描可见纤维表面粘附有聚多巴胺纳米膜。

扫描电镜观察多巴胺修饰前后的纤维膜粘附血小板的情况发现,未经修饰的血小板粘附数量少,大部分处于激活状态,经过多巴胺修饰后血小板粘附数量与未经修饰组比较明显增多（p<0.05）,大量血小板仍保持未激活状态。

Live/dead染色分析,血小板促进细胞的粘附和增殖,与其他组别对比培养3天后细胞数目较多,大量细胞沿纳米纤维走向排列,呈现一定的规律性。

免疫荧光鉴定发现PCL/gelatin纳米纤维膜+多巴胺+血小板组的细胞阳性率显著高于前两个对照组（p<0.05）,与加入内皮细胞培养基的阳性对照组无差别（p>0.05）。

结论：

本研究采用纳米纤维拓扑结构,聚多巴胺和血小板联合作用于脂肪干细胞,实现向内皮细胞诱导分化。

综合物理表征和内皮细胞表征物鉴定,PCL/gelatin纳米纤维膜+多巴胺+血小板可作为内皮化结构单元参与骨多级组装,构建血管网络。

三、磁性模块目的：

制备磁性纳米纤维膜结构单元充分实现无接触,无创的磁场操控。

材料与方法：

首先采用化学共沉淀法制备超顺磁性纳米颗粒SPIONs。

分别称取PCL和明胶各1g加至10ml三氟乙醇溶液中进行磁力搅拌4h,取PCL和明胶溶液各5ml混合后继续搅拌2h。

先将500mgSPIONs混合lml2%F-127溶液中超声促分散,再按比例将SPIONs加入到聚合物溶液中,得到SPIONs占聚合物的比例为2.5wt%,5wt%,10wt%的三种混合液。

将混合液加至注射器中,安装至推注器上,调整速度为1ml/h,电压为15kv,采用不锈钢框接收,接收距离为15cm。

接收时间为1h磁性纳米颗粒和磁性纳米纤维的物理表征对得到磁性纳米颗粒和磁性纳米纤维膜进行SEM,TEM,FTIR,XRD,磁性分析。

磁性组装测试。

结合层层叠加,将5层磁性纳米纤维膜进行磁性组装实验。

磁性纳米纤维的生物学检测和MRI成像测试利用live/dead染色分析磁性纳米纤维膜对脂肪干细胞的毒性。

利用超顺磁性纳米粒子在MRI成像技术上的优势,将磁性膜植入到大鼠腹部皮下,观察利用磁性膜对移植体的示踪和无创检测效果。

结果：

根据SEM和TEM分析,加入磁性颗粒后,纤维膜结构变得较为致密,孔隙变小,纤维直径变小。

磁性颗粒在纤维中散在分布,没有出现严重的聚集情况。

磁性分析发现,单纯的磁性纳米颗粒的磁饱和度为65.2emu/g,随着加入的磁性纳米颗粒浓度的升高,磁性纳米纤维的磁饱和度逐渐升高,2.5wt%时约为6.3emu/g,5wt%时为11.8emu/g,10wt%时为19.2emu/g。

FTIR,XRD检测显示,磁性纳米粒子在磁性纳米纤维中的存在和晶体结构良好。

磁性组装实验发现,5层10wt%组磁性膜叠加,在不施加外在磁场时,层与层之间距离较大,结构松散,不稳定。

施加磁场后,受磁吸引力作用,多层膜迅速向磁场强的方向聚拢,紧紧贴附在玻璃片上,在磁场存在下结构稳定。

并且可以在液体中实现对单个膜片的移动操控。

将磁性膜种植于大鼠腹部皮下后,第三天可通过MRI成像清晰的看到支架材料在体内的状态。

证明了进行移植体示踪和无创检测的可能性。

细胞live/dead染色分析发现,种植第3天后,细胞在各比例的磁性膜上存活状态良好,证明磁性膜具有良好的生物相容性。

结论：

通过在PCL/gelatin纳米纤维中添加磁性纳米颗粒,可制备超顺磁性的纳米纤维膜。

并在外加磁场下,检测到磁性驱动组装的效果。

且磁性膜具有良好的生物相容性和MRI成像增强效果。

可为进一步制备骨多级结构,提供磁性组装单元。

四、多级骨组织的制备目的：

依据bottom-up组织工程策略,利用已制备的三个独立功能的模块,进行大体积的血管化骨组织构建。

材料与方法：

三种模块的制备,参照前面的介绍。

具体组装方法,我们采用了层层叠加和磁性驱动组装相结合,以一层内皮层为中心,两边加入成骨层,最外层再加上磁性组装层,以磁性驱动使五层膜紧密叠加在一起。

在培养过程中,保持磁场的存在。

在叠加培养后第7天,对结构的稳定性进行检测。

采用HE染色,免疫荧光分析多层膜的层次结构关系。

结果：

培养7天后发现三种单独模块叠加组和单纯PCL/gelatin模块叠加组,在不施加外在接触式作用的情况下无法实现结构稳定的组装。

这些多层膜结构受液体波动影响,不能保持完整性,细胞只限在单层纤维膜上生长。

在磁性驱动下,复合多层膜之间的空间距离被压缩,被固定于培养皿中与磁场相对应的位置,对液体的波动产生一定的抵抗,整个培养过程中,保持良好的稳定性,为膜与膜之间细胞连接的形成提供了必要条件。

在进行7天的叠加培养后,多层膜结构在撤去磁场的情况下,依然保持良好的稳定性,结构在液体波动和各种操作中保持良好完整性。

采用HE染色,CD31免疫荧光分析多层膜的结构层次,多层膜磁性组装后可得到结构稳定,紧凑的复合有内皮层的多级骨组织。

结论：

利用三种不同功能的结构单元,本研究实现了多级骨组织的构建,在磁场的作用下促进了结构稳定性的保持,为大体积带血管骨组织的制备提供了新的思路。

第二部分五、改性海藻酸-壳聚糖水凝胶修复软骨缺损目的：

改性海藻酸多糖结构,构建一种新型可注射性的具有修复软骨作用的水凝胶。

材料与方法：

应用1-氨基-3,3二乙氧基丙烷修饰海藻酸,并在其上形成半缩醛基,将以上修饰过的海藻酸与壳聚糖结合37℃C下反应形成水凝胶。

FTIR,SEM和流变学检测分析水凝胶的化学合成变化,孔隙率和机械性能流变学的特点。

提取兔骨髓干细胞,扩增培养至第三代用于实验。

将骨髓干细胞与水凝胶复合培养,采用live/dead染色分析2天后细胞的存活情况。

采用CCK-8检测培养多个时间点后细胞的增殖情况。

制备兔膝关节软骨缺损模型,在股骨远端关节面采用磨钻制造直径5mm,深度2mm的环形缺损。

实验动物共分四个组,正常对照组,缺损对照组,水凝胶修复组,干细胞复合水凝胶修复组。

动物术后常规饲养12周后。

取出股骨远端,观察修复效果,一部分标本固定进行组织学染色评价,一部分标本提取RNA进行荧光实时定量PCR分析软骨相关基因的表达变化。

结果：

通过激活羧酸侧链在海藻酸引入酰胺键,加盐酸后可产生半缩醛,在近生理环境下壳聚糖（CS）与修饰过的海藻酸（AALG）可通过希夫碱反应形成水凝胶。

SEM观察水凝胶表面显示出大小约几十个微米孔隙,结构均匀一致。

FTIR和流变学分析证明了水凝胶的化学反应和物理性能变化。

Live/dead染色观察发现细胞在水凝胶中存活良好,CCK-8增殖实验证明细胞在水凝胶中的增殖趋势与普通培养一致。

采用兔软骨缺损模型进行体内实验评价,12周后发现干细胞复合水凝胶组修复效果明显。

HE染色,阿利新兰染色,Masson三染色分析发现干细胞复合水凝胶组出现大量软骨细胞,细胞外基质分泌增多,实现透明软骨修复,水凝胶组,缺损组,修复效果差,细胞量较少,骨性基质堆积。

基因检测证明干细胞复合水凝胶组中aggrecan,collagenⅡ,proteoglycans,Sox9,表达明显高于水凝胶修复组,缺损组,而缺损组的collagenⅠ高于干细胞复合水凝胶修复组,和水凝胶修复组。

结果显示水凝胶复合骨髓干细胞后在软骨缺损部分形成了大量新生软骨组织。

结论：

应用1-氨基-3,3二乙氧基丙烷修饰海藻酸得到水凝胶对软骨修复效果良好。

对进一步利用多糖类材料提供新的实验支持。