双选择剂毛细管电泳法分离两个质子泵抑制剂对映体.docx
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双选择剂毛细管电泳法分离两个质子泵抑制剂对映体
沈阳化工大学
本科毕业论文
题目：
双选择剂毛细管电泳法分离两个质子泵抑制剂对映体
院系：
应用化学学院
专业：
应用化学
班级：
应化1003
学生姓名：
赵越
指导教师：
关瑾副教授
论文提交日期：
2013年6月24日
论文答辩日期：
2013年6月25日
摘要
手性药物的生物活性与其立体构型密切相关。
目前新药研究的一个发展趋势是研制和生产光学纯的药物。
手性药物的研究已成为为国际新药研究的方向之一。
手性药物分析在手性药物研究中作用越来越重要，已经成为国际上分析科学中的热点和难点。
本文利用高效毛细管区带电泳法（CZE）对奥美拉唑和泮托拉唑两个质子泵抑制剂进行手性分离分析方法的研究。
系统考察了背景电解质的种类、浓度及pH，金属离子和配体的比率及浓度，分离电压对对映体分离的影响。
拉唑的紫外最大吸收波长为290nm，进样时间为10s，质子泵抑制剂的浓度为1mg/ml，背景电解质的pH为5.0，Cu2+与L-His的浓度比为1:
1.5，Cu2+的浓度为10mmol/L，分离电压为15kV的优化条件下达到基线分离。
本研究对于研究拉唑类药物的体内药动学过程、确定药动学参数、阐明药理毒理机制以及在单一对映体化合物的合成和质量控制方面都具有重要意义。
关键词：
毛细管区带电泳；手性分离；质子泵抑制剂；配体;双选择剂
Abstract
Bioactivityofchiraldrugsiscloselyrelatedtothestereostructures.Nowadaysdevelopmentandproductionofopticallypuredrugsisthetrendofnewdrugsresearch.Thestudyonchiraldrugshasbecomeoneofnewdirectionsofnewdrugsresearchinternationally.Analysisofchialdrugs,withincreasinginimportanceinpharmaceuticalresearch,isnowahotanddifficulttopicininternationalanalysisscience．
Inthisthesis,highperformancecapillaryelectrophoresismethodwasusedforthechiralseparationstudyofprotonpumpinhibitionsincludingpantoprazole,andomeprazole.TheeffectsofpH,typeandconcentrationofrunningbuffer,ratioandconcentrationofligand,appliedvoltageonresolutionwereinvestigated.Optimalseparationconditionswere1mg/mlprotonpumpinhibitions,10mmol/LcopperacetatePH5.0,ratioofCu（Ⅱ）andL-Hiswas1:
1.5,withanappliedvoltageof15kVanddetectedatawavelengthof209nmandinjectedin10s.Thedevelopmentofchiralseparationmethodsisverysignificantinstudyingandunderstandingofinvivopharmacokineticprocessesandpharmacokineticparameters,thepharmacologicaland/ortoxicologicaleffectsofprotonpumpinhibitions,thesynthesisandqualitycontroloftheenantiomerofprotonpumpinhibitions.
Keywords:
protonpumpinhibitions,capillaryzoneelectrophoresis,chiralseparation;ligand-exchangeDoublechoiceagent
目录
引言1
一、文献综述2
1.1手性药物2
1.2手性化合物的分离分析方法3
1.2.1毛细管电泳的特点3
1.2.2毛细管电泳的分离模式4
1.2.3毛细管电泳法在药物分离分析中的应用进展5
1.3质子泵抑制剂研究概况5
1.4毛细管电泳法在药物品质质量管理方面的应用研究7
1.5本文研究的目的与内容7
二、实验部分8
2.1.1仪器、试剂和样品8
2.1.2电泳条件8
2.1.3溶液的配制9
三、实验结果与讨论10
3.1.1背景电解质的种类对拉唑分离分析的影响10
3.1.2背景电解质的浓度对质子泵抑制剂分离分析的影响10
3.1.3背景电解质的pH质子泵抑制剂分离分析的影响11
3.1.4金属离子与配体的比率及浓度对质子泵抑制剂离分析的影响13
3.1.5β-环糊精浓度对质子泵抑制剂分离分析的影响15
3.1.6分离电压对质子泵抑制剂分离分析的影响16
3.2手性分离机理的探讨18
四、结论19
参考文献20
致谢23
附录24
附录1英文文献原文24
附录2英文文献翻译35
引言
质子泵抑制剂是早期在研究抗病毒药物时发现的。
1972年，人们在研究吡啶硫代乙酰胺的抗病毒作用时发现它有抑制胃酸分泌的作用，该化合物对肝脏的毒性作用可能与-CONH2基团有关。
改用硫脒取代-CONH2得到H7767，具有抗胃酸分泌的作用。
在此基础上，人们经过结构改造发现了替莫拉唑（Timoprazole）抗酸分泌作用很强，为此人们又继续对其结构开始改造。
目前手性药物的拆分方法主要有经典结晶法、化学拆分法、生物拆分法、膜分离法、手性液-液拆分法和色谱法等，其中色谱法由于简便快捷、分离效果好而被认为是手性药物异构体拆分最有效的方法。
色谱拆分方法主要包括薄层色谱（TLC）、超临界流体色谱（SFC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳色谱法（CE）等。
毛细管电泳色谱具有选择性强、高效、快速、微量、多模式、经济、环保等特点，在手性拆分领域显示了明显的优势。
CE和高效液相色谱法都是高效分离技术，与HPLC相比CE几乎不消耗溶剂，所需样品为nL级，而HPLC比CE所需的样品量要大且流动相消耗量大，CE仪器远没有HPLC那样复杂，没有高压泵，仪器成本比HPLC更低，柱效远远高于HPLC。
CE在手性药物分析方法的研究主要集中在手性添加剂和分析条件的优化上，它与GC和HPLC相互补充，已成为近年来手性拆分领域的热点。
本文依据毛细管电泳技术新的研究进展，对毛细管电泳技术及其在质子泵抑制剂拆分中的应用做一简单综述。
一、文献综述
1.1手性药物
在立体化学中，有一类化合物，它们的结构基团相同，但在空间三维排列不同，它们被称为立体异构体，而在空间上不能重叠，互为镜像关系的立体异构体称为对应异构体（简称对映体，enantiomer），它们有使平面偏振光发生偏转的性质——旋光性。
在对映体中，能使平面偏振光按顺时针方向旋转的对映体右旋体（dextroisomer），以符号d或（+）表示；能使平面偏振光按逆时针方向旋转的对映体称为左旋体（levoisomer），以符号l或（-）表示。
由于这一对化合物就像人的左右手一样，因此以“手性”来命名这类化合物，见图1-1。
图1-1手性结构图
Figure1-1Thestructuresofchirality
手性药物是指药物的分子结构中存在手性因素的药物，手性药物在药物中占有很大的比例，而且近年来单一对映体手性药物的市场一直保持持续增长。
人类对手性药物的重要性曾经缺少认识，有过惨痛的教训。
比较典型的事件是上个世纪五十年代开发的一中治疗孕妇早期不适的消旋体药物“反应停（thalidomide）[1]”。
该药效果很好，被广泛使用，但很快发现服用过“反应停”的孕妇生出的婴儿大多四肢残缺。
虽然世界各国立即停止销售“反应停”，但已造成了数以千计的婴儿畸形。
后来研究发现其中R构型具有缓解妊娠反应作用，而S构型有导致畸形的作用。
由此，人们对药物的手性产生的作用开始重视，意识到研究手性化合物对于科学研究以及人类健康有重要意义。
1.2手性化合物的分离分析方法
现代色谱分离技术在手性化合物对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越性[2]。
常用的手性分离色谱技术有高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）、超临界流体色谱法（SFC）、气相色谱法（GC）以及薄层色谱法（HPLC）等。
其中GC只能分析挥发性物质，有一定局限性；HPCL和CE在手性分离中发挥了及其重要的作用，但HPCL柱价格昂贵，消耗溶剂量较大；CE法是20世纪80年代以来新兴的一种分离技术，由于它具有高效、快速、简便等特点，包括多种灵活的分离模式，其中除毛细管等电聚焦（CIEF）外，其它分离模式都可以用于手性分离，是较为有效的手性拆分技术。
毛细管区带电泳法（CZE）是基于离子或者荷电粒子在一定PH的自由溶液中以电场为驱动力，在毛细管中按照电泳淌度的不同进行分离的一种模式。
其原理是电解质缓冲液中添加了手性选择剂，由两个对映体和手性选择剂构成了三点作用模式，所形成的包容络合物稳定性不同，使它们的表观迁移率产生差异，从而使对映体得到分离。
根据手性选择剂类型，CZE具体可以分为配体交换的CZE、以环糊精为手性添加剂的CZE、以冠醚为手性添加剂的CZE、以蛋白质为手性添加剂的CZE、以大分子抗生素为手性添加剂的CZE、以糖类为手性添加剂的CZE等。
1.2.1毛细管电泳的特点
CE作为一项新兴分离分析技术，与GC、HPLC相比，具有以下特点：
高质量高灵敏度。
常见外检测器的检测限可达10-13~10-15mol。
分析速度快、分离效率高。
CE的分析时间通常为3~30min，而且柱效高，通常理论塔板数在105以上[3]。
适用范围广。
CE不仅能分析有机与无机阴阳离子、手性分子、中性分子[4]，还可分析核酸、蛋白质、多肽类药物等大分子样品，甚至还能分离各种颗粒（如硅胶颗粒等）。
实验成本低，消耗少。
常用的毛细管非常廉价，而且CE分离多在水介质中进行，消耗的大多为价格低廉的无机盐类，进样量在μL级或ng级。
毛细管柱易清洗，样品前处理简单。
操作模式多。
只需要更换毛细管内溶液的种类、浓度、酸度或添加剂，就可以实现一台仪器多种分离模式。
1.2.2毛细管电泳的分离模式
分离模式多样化是毛细管电泳法的一个重要的特点及优点，它成就了毛细管电泳发广泛的适用范围、高选择性、分离速度快、成本消耗低等优点，使得毛细管电泳法在分离科学研究中占据极其重要的地位。
分离模式如下：
（1）毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis，CZE）：
CZE是基于各被分离物质的净电荷与质量比间的差异，不同离子按各自表面电荷密度的差异，以不同的速度在电解质中移动而致分离。
CZE适用于蛋白质、氨基酸、肽对映体的分析和离子分拆，但不能分拆中性分子和不带电的物质。
迄今为止，CZE仍是应用最普通的一种模式。
（2）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）：
CGE是在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。
另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质，如葡聚糖、聚环氧乙烷，装入毛细管中进行分析，称毛细管无胶筛分电泳，故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳[5]，下分为凝胶和无胶筛分两类。
（3）胶束电动毛细管色谱（MicellarElectrokineticCapillaryChromatography，MECC）：
MECC在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水相和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。
本模式能用于中性物质的分离，是目前研究最多的一中模式
（4）亲和毛细管电泳（AffinityCapillaryElectrophoresis，ACE）：
在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。
（5）毛细管电色谱（CapillaryElectrochromatography，CEC）：
是将高效液相色谱的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，此模式兼具电泳和液相色谱[6]的分离机制。
（6）毛细管等电聚焦电泳（CapillaryIsoelectricFocusing，CIEF）：
是通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内建立了pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带，聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH使溶质通过检测器。
（7）毛细管等速电泳（CapillaryIsotachrophoresis，CITP）：
是一种古老的模式，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。
常作为柱前浓缩方法用于富集样品，主要用于分离离子型物质如有机酸.
（8）毛细管列阵电泳（CapillaryArraelectrophoresis，CAE）：
即在多根毛细管组成的毛细管列阵中，利用一个共焦激光荧光扫描检测系统同时进行多道分析的电泳技术。
利用这以技术，在99根毛细管组成的列阵中进行了DNA序列分析的尝试，结果令人兴奋。
（9）芯片毛细管电泳（MicrochipCE）：
即将反应、分离、检测集中在一个芯片上进行的毛细管电泳。
1.2.3毛细管电泳法在药物分离分析中的应用进展
近年来，药物分离分析方面的研究在国内外十分活跃。
对其研究可分为三大部分：
一种是原料药的定量、杂质检测、药剂分析以及对它们稳定性的评价等[7]以药品质量管理为目的的测量方法；一种是进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄[8]等体内动态的研究；还有一种是手性药物对映体的拆分[9]，现已成为新药研究开发中的焦点和热点。
其中，毛细管电泳法在后者的研究领域应用最为广泛，起着举足轻重的作用。
1.3质子泵抑制剂研究概况
质子泵抑制剂（protonpumpinhibitor，PPI），即H+/K+-ATP酶抑制剂，主要用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡、反流性食管炎、Zollinger-Ellison综合症等，能抑制基础胃酸的分泌及组胺、进食等多种刺激引起的胃酸分泌，具有起效快、作用强和持续时间长的特点，是治疗胃酸相关性疾病大的首选药物。
世界上第一个质子泵抑制剂奥美拉唑（omeprazole）于1988年上市，该药一经上市即迅速成为抗消化性溃疡的主力军，兰索拉唑（lansoprazole）、泮托拉唑（pantiprazole）和雷贝拉唑（rabeprazole）先后于1992、1994和1998年在法国、德国和日本相继上市，泰妥拉唑（tenatoprazole）为新一代长效质子泵抑制剂，由法国Negma公司开发了新一代长效质子泵抑制剂-泰妥拉唑（Tenatoprazole），现正处于Ⅱ期临床。
其中泰妥拉唑和奥美拉唑为吡啶併咪唑化合物，其余三种质子泵抑制剂均为苯併咪唑类化合物，它们具有相似的结构特征，分子中存在一个手性硫原子中心，为一对对映体组成的混合物，此类药物的药效学和药动学表现出对映体差异性。
魏越浩[10]选择58例十二指肠溃疡幽门螺杆菌再感染复发患者，采用奥美拉唑新三联法治疗1W后，再感染根除率为93%。
2001年，英国阿斯利康公司开发出左旋对映体S-奥美拉唑（esomeprazole，商品名：
Nexium），其抑酸作用强于消旋体，副作用少，已成为胃酸相关性疾病治疗的首选药物。
至此该类药物单一对映体的研究日益火热。
目前对质子泵抑制剂的手性分离报道主要为分离泮托拉唑、奥美拉唑、兰索拉唑和雷贝拉唑对映体的手性固定相HPLC法[11-14],手性固定相SFC法[15]和以牛血清白蛋白[16]和环糊精[17]为手性添加剂毛细管电泳法，鲜有关于手性配体与金属离子作为选择剂对质子泵抑制剂对映体进行分离的毛细管电泳法的报道。
五个质子泵抑制剂结构图，见图1-2。
图1-2泮托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑、奥美拉唑和泰妥拉唑结构式
Fig.1-3Chemicalstructuresof,lansoprazole,rabeprazole,omeprazoleandtenatoprazole
1.4毛细管电泳法在药物品质质量管理方面的应用研究
目前，常作药品的定量分析方法的有滴定法[18]、光谱分析法[19]、色谱分析法等。
其中，色谱分析法主要包括纸色谱法[20]、薄层色谱法[21]、柱色谱法[22]、气相色谱法[23]、液相色谱法[24]及毛细管电泳法[25]等。
近年来，CE作为一种分拆技术的后起之秀，在药品成分鉴别、原料药含量测定、纯度检验、制剂有效成分测定、复杂基质中药物及微量元素测定等方面的应用越来越广泛。
毛细管电泳法的定量分析过程是根据药物标准溶液响应信号（峰高或峰面积）之间的关系来计算含量，由于峰形随样品浓度变化而变化，峰高与样品浓度的线性关系r不甚稳定，故常用峰面积来定量。
毛细管电泳虽然优点很多，但重现性差，因此常用内标法定量[26]，以提高精密度。
田春秋[27]等人用高效毛细管电泳法检测牛奶中青霉素中间体以及3种青霉素类药物，加标回收率为84.91%~96.72%，RSD为1.11%~9.11%，该法满足牛奶质量检测中4种PENs的检测要求。
关瑾[28]等用毛细管区带电泳法同时分离测定乙醛酸和草酸含量，该法通过方法学验证，具有良好的线性关系，已用于实际样品的分析。
1.5本文研究的目的与内容
基于以上研究背景，本文的研究目的是建立、简便的手性分离方法分析质子泵抑制剂对映体，对其手性对映体分离机制进行研究，对建立的分析方法进行方法学研究。
本文主要是采用CE法，以L-His和Cu2+的配合物及β-CD为手性选择剂，对质子泵抑制剂对映体进行分离分析的研究，同时考察电压、浓度、PH值和比例等对分离度和分离时间的影响。
二、实验部分
2.1.1仪器、试剂和样品
仪器：
仪器
厂家
HV-30I高压电源
北京彩陆科学仪器有限公司
UV-K-2501型紫外检测器
北京彩陆科学仪器有限公司
高效毛细管电泳仪
北京彩陆科学仪器有限公司
PHSJ-5型PH计
上海紧密科学仪器有限公司
BSA224S-CW型电子天平
北京赛多利斯天平有限公司
KQ5200DB型数控超声波清洗器
昆山市超声仪器有限公司
熔融石英毛细管（50μmI.D.）
河北永年锐沣色谱器件有限公司
试剂：
试剂
厂家
L-组氨酸（L-His）（BR）
国药集团化学试剂有限公司
β-环糊精（≧99.0%）
国药集团化学试剂有限公司
甲醇（色谱纯）
山东禹王实业有限公司禹城化工厂
乙酸铜（分析纯）
国药集团化学试剂有限公司
氢氧化钠（分析纯）
沈阳化学试剂厂
磷酸二氢钠（分析纯）
广东汕头市西陇化工厂
样品：
样品
厂家
泮托拉唑（≧99.0%）
武汉远城共创科技有限公司
奥美拉唑（≧99.0%）
武汉远城共创科技有限公司
兰索拉唑（≧99.0%）
武汉远城共创科技有限公司
泰妥拉唑（≧99.0%）
武汉远城共创科技有限公司
2.1.2电泳条件
背景电解质溶液：
精密称取乙酸铜、磷酸二氢钠、β-环糊精、L-组氨酸溶于二次蒸馏水中，浓度、PH根据具体实验要求调整、配制：
毛细管柱：
总长50cm，有效长度48，内经50μm；
检测波长：
泰妥拉唑306nm，泮托拉唑、奥美拉唑、兰索拉唑290nm；
洗柱方式：
毛细管依次用0.1mol/L氢氧化钠、二次蒸馏水、缓冲溶液各冲洗10min后进样；进样间用二次蒸馏水、缓冲溶液各冲洗5min后进行下次进样；
进样方式：
采用虹吸进样，进样高度差10cm，正极进样负极检测；进样时间10s；
柱温：
室温。
背景电解质和样品溶液在使用前均经0.45μm微孔滤膜过滤，并超声脱气。
2.1.3溶液的配制
样品贮备溶液的配制：
分别精密称取10mg泮托拉唑、奥美拉唑、兰索拉唑和泰妥拉唑溶解后移置10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制备成1.0mg/mL的贮备液，-20℃冰箱保存。
样品供试溶液的配制：
精密量取各样品贮备液1mL分别至10mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，得100μg/mL供试溶液，4℃冰箱保存。
0.1mol/L氢氧化钠溶液的配制：
称取氢氧化钠约0.4g，溶解于100mL蒸馏水中，摇匀即得。
三、实验结果与讨论
3.1.1背景电解质的种类对拉唑分离分析的影响
在实验过程中，我们分别考察了相同浓度的磷酸二氢钠、醋酸铜、L-组氨酸、β-环糊精以及上述溶液不同比例的混合液作为背景电解质体系，对奥美拉唑、泮托拉唑进行分离分析的研究。
实验得出结论：
在背景电解质浓度相同的情况下，磷酸二氢钠和β-环糊精为背景电解质时，奥美拉唑、泮托拉唑有分离迹象。
所以选择磷酸二氢钠和β-环糊精作为背景电解质进行分离分析的研究。
以左旋出峰时间为例记录以下数据。
3.1.2背景电解质的浓度对质子泵抑制剂分离分析的影响
本实验考查了磷酸二氢钠的浓度为1、3、5、8、10mmol/L时对迁移时间和分离度的影响，实验结果如图3-1、3-2所示：
图3-1磷酸二氢钠浓度对分离度的影响
Fig.3-1EffectofconcentrationofNaH2PO4onresolution
图3-2磷酸二氢钠浓度对迁移时间的影响
Fig.3-2EffectofconcentrationofNaH2PO4onmigrationtime
从图3-1、3-2中可以看出，当磷酸二氢钠浓度为5mol/L是奥美拉唑的分离度相对较大，而此时的泮托拉唑离度也接近峰值，两个质子泵抑制剂的迁移时间也相对较小。
综上所述我们选择磷酸二氢钠浓度为5mol/L作为两个质子泵抑制剂的最佳分离条件。
3.1.3背景电解质的pH质子泵抑制剂分离分析的影响
在毛细管电泳中，背景电解质的pH对手性分离有着至关重要的作用，因为pH的改变直接导致配体、手性药物以及金属离子的解离状况，从而从根本上改变配位反应的平衡。
背景电解质溶液的pH影响分析物的有效电荷，决定其在电场中的迁移时间，通过改变pH，可以改变化合物的电泳迁移速率的大小。
pH同时还影响毛细管内壁硅羟基的电离平衡，影响电渗流大小。
实验中，我们分别考察了背景电解质溶液pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的实验条件对迁移时间和分离度的影响。
实验结果如图3-3、3-4所示：
图3-3pH对分离度的影响
Fig.3-3EffectofbufferpHonresolution
图3-4PH对迁移时间
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