注射用重组人干扰素α2b稳定性分析.docx

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注射用重组人干扰素α2b稳定性分析

摘要

结合本人在某公司实习的相关经历与心得，本文将对该公司主导产品“注射用重组人干扰素α2b的稳定性加以分析，并最终得出科学的结论。

关键词：

注射用重组人干扰素α2b，稳定性，分析。

摘要………………………………………………………………………1

引言………………………………………………………………………3

第一章注射用重组人干扰素α2b简介…………………………………3

第一节基因工程菌E.coliDH5α/pUB419……………………..…4

第二节生产工艺……………………………………………………4

第三节质量控制................................................................................5

第二章注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）稳定性实验…6

第一节实验目的……………………………………………………6

第二节实验材料……………………………………………………6

第三节实验方法………………………………………………..…..6

第四节结果与分析…………………………………………………7

第五节结论……………………………………………………...….8

第三章结论………………………………………………………………9

参考文献………………………………………………………………..….11

引言

1957年IsaacsLindenmann发现干扰素及其作用，20世纪80年代，美国、瑞士等国的科学家以基因工程的方式，把干扰素制备成治疗药物，投放市场，它很快成为国际公认的治疗肝炎、肿瘤等疾病的首选药。

注射用重组人干扰素α2b主要用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卡波氏肉瘤、卵巢癌、基底细胞癌、表面膀胱癌等。

还可用于治疗某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣。

第一章注射用重组人干扰素α2b简介

第一节基因工程菌E.coliDH5α/pUB419

将含有人α2b干扰素基因cDNA的pBT319用EcoRI和PstI酶消化，通过克隆，组建高效表达目的基因的质粒pUB419，将此质粒转化大肠杆菌DH5α株，建成高效表达人α2b干扰素的工程菌。

α2b干扰素cDNA插入片断的核苷酸序列，经测定与文献报导相符。

质粒pUB419特点为：

一、Trp启动子，以增强表达量；

二、四环素抗性基因；

三、质粒-宿主稳定性好。

目的基因表达产物经免疫方法鉴定，它的活性不能被抗人α1干扰素，抗γ干扰素血清所中和，而能被抗人白细胞和类淋巴细胞所中和。

产物分子量及氨基末端氨基酸序列与文献报导的人α2b干扰素相同。

第二节生产工艺

一、工程菌发酵工艺

在摇瓶研究的基础上，使用B.Braun公司10升自动发酵罐进行了大量试验。

对培养基的配方及补料方式逐项进行了深入的研究，建立了工程菌高密度、高表达发酵工艺。

工程菌发酵周期15-17小时，发酵最终浓度为100g菌体湿重/L左右，效价稳定在8－10×108IU/L。

二、干扰素纯化工艺

具体纯化路线为：

高压匀浆破菌→酸碱变性处理→硫酸铵盐析级分→葡聚糖凝胶脱盐→CM纤维素离子交换层析→单克隆抗体免疫亲和层析→分子筛凝胶过滤层析。

菌体经匀浆缓冲液悬浮后，通过高压匀浆泵2次匀浆处理，可将绝大部分菌体彻底破碎，经高速离心分离得到的上清液用盐酸调至pH2.5左右，充分利用了α干扰素耐酸性的特点，使大量杂蛋白及核酸类物质变性沉淀。

这样离心后得到的上清再经硫酸铵盐析级分，大大地浓缩了提取液，并有较好的纯化效果。

然后，通过脱盐、上CM纤维素柱层析，进一步去除了杂蛋白及核酸，为进行免疫亲和层析作好了准备。

经过单抗亲和层析，产品纯度一般可达90%。

再经过分子筛层析，就能顺利地得到纯度95%以上的α2b干扰素成品。

第三节质量控制

质量控制参照《中国生物制品规程》2000年版重组人干扰素α2b制造及检定规程进行。

第二章注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）

稳定性实验

第一节实验目的

考察注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）在实际保存条件（2~8℃）下，长期存放其外观（是指冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、生物活性、pH值随时间变化的规律。

第二节实验材料

一、稳定性试验设备：

2~8℃冰箱。

二、生物活性测定。

三、pH值测定：

酸度计，标准pH值溶液（4.00；6.86；9.18）。

四、成品外观色泽及澄明度测定：

标准浊度液、伞棚灯。

五、无菌试验：

百级层流、隔水式电热恒温培养箱、硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基。

第三节实验方法

一、稳定性重点考察项目

成品的外观（是指冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、生物学活性、pH值、温度。

其它检测项目：

无菌试验。

二、长期试验

见《中华人民共和国药典》2000年版二部附录XIXC“药物稳定性试验指导原则”。

供试品于2~8℃放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月，按稳定性重点考查项目进行检测，12个月后继续考查，分别于18个月、24个月、36个月取样进行检测，将结果与0月比较，对结果进行统计分析。

在试验结束时做无菌试验检测，将结果与0月比较。

三、实验样品

注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）连续三批生产样品：

表1.注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）

2ml西林瓶装

规格IU/支

批号

检测日期

500万

20030301

03年3月

15日

03年4月

13日

03年6月

17日

03年9月

15日

03年12月18日

04年3月

15日

04年9月

15日

20030302

20030303

（二）对照样品：

注射用重组人干扰素α2b（300、100万国际单位）连续三批生产样品：

表2.注射用重组人干扰素α2b（300、100万国际单位）

2ml西林瓶装

规格

IU/支

批号

检测日期

300万

20010204

01年

2月

15日

01年

3月

17日

01年

5月

16日

01年

8月

15日

01年11月

14日

02年

2月

15日

02年

8月

17日

02年

2月

15日

03年2月

17日

20010205

20010206

100万

20010201

20010202

20010203

第四节结果与分析

一、测定结果

（一）注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）连续三批生产样品的稳定性：

稳定性考察结果见表3、表5。

以存放时间为t，以相当于0月活动的百分数的对数为纵坐标，做log（C/C0）对t的散点图，并做趋势分析，见图1。

（二）注射用重组人干扰素α2b（100、300万国际单位）（西林瓶装对照）三批样品的稳定性见表4、表6及图2、图3。

二、结果分析

（一）外观（色泽、澄明度）等变化

注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）于2~8℃存放条件下，生产样品在18个月后成品外观（是指冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、pH值未发现明显变化，无菌试验均合格。

（二）生物学活性变化

1、注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）连续三批样品：

经2~8℃存放18个月后生物学活性相当于0月活性的96.6%，仍符合质量标准，与初步稳定性实验“9个月活性无较大变化”的结果相符。

根据表7和图1进行回归分析，结果表明注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）在2~8℃实际保存条件下，在30.7个月内其生物学活性仍能符合质量标准。

与对照品（100、300万国际单位）稳定性长期实验结果比较，100、300万和500万IU/支三个规格在2~8℃实际保存条件下，存放18个月其活性仍相当于0月活性的97%左右；保存24个月时100、300万国际单位二个规格的活性仍在98%左右。

2、对照品（100、300万国际单位）：

连续三批产品在2~8℃保存31个月后生物学活性相当于0月活性的85%，符合质量标准；36个月后生物学活性相当于0月活性的83%以上，根据图2和图3的分析结果表明：

100、300万IU/支2个规格在2~8℃实际保存条件下有效期在30个月以上。

三批产品（100、300万IU/支）经阴凉库留样及实际保存条件的稳定性考察，产品有效期也在30个月以上。

见表4、表6。

第五节结论

一、注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）的在2~8℃实际保存条件下随时间变化的指标是：

生物学活性。

二、注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）18个月内很稳定，与对照品注射用重组人干扰素α2b（100、300万国际单位）比较，稳定性基本相同。

故初步认为注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）的有效期在30个月以上。

第三章结论

按《中国药典》2000年版“药物稳定性试验指导原则”，100万IU、300万IU/支三批成品在2~8℃保存36个月，500万IU/支观察18个月。

100万IU、300万IU/支二个规格保存24个月活性基本不下降；36个月时其生物活性相当于0月活性的83%以上。

规格为500万IU/支在观察的18个月内其生物学活性基本不下降。

根据长期实验数据进行回归分析，得出：

100万IU、300万IU和500万IU/支3个规格在2~8℃分别存放31.9、42.5、30.7个月其生物学活性相当于0月活性的85%。

即其生物学活性保存30个月以上仍能相当于0月活性的85%。

仍能符合企业内控标准和国家标准（国家标准为该规格标示量的80%~150%，企业内控标准为85%~145%）。

参考文献

国家药典委员会：

《中国药典》，化学工业出版社，2000年版。

国家药典委员会：

《中华人民共和国药典》，化学工业出版社，2000年版。

中国生物制品标准化委员会：

《中国生物制品规程》，化学工业出版社，2000年版。

表3.注射用重组人干扰素α2b（500万国际单位）稳定性试验结果

保存条件：

2~8℃生产日期：

2003年2月包装：

2ml西林瓶装、药用氯化丁基橡胶塞及铝塑组合盖，与100、300万国际单位包装一致

存放时间（月）

测定时间

2003年3月

2003年4月

2003年6月

2003年9月

2003年12月

2004年3月

2004年9月

20030301

干扰素α2b活性（×106万IU/ml）

5.32

5.36

5.47

5.32

5.30

5.20

5.12

pH值

7.0

外观

白色，溶解后无色、澄明

无菌试验

阴性

20030302

干扰素α2b活性（×106万IU/ml）

5.16

5.14

5.17

5.20

5.19

5.17

5.03

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