小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生长的影.docx

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小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生长的影

小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生长的影

张志培，施新猷，李六金，刘雪松，江逊，彭磊，赵佐庆

【关键词】肝癌细胞

　　关键词:

肝癌细胞;接种;免疫缺点小鼠;T细胞;细胞毒;流式细胞仪

摘要:

目的探讨不同免疫力小鼠的免疫细胞对人类肝癌细胞系9724生长的阻碍及异种特异性细胞毒杀伤能力.方式将培育后的人类肝癌细胞系接种到不同免疫力小鼠（免疫正常的BALB/c，B缺点的CBA/N，T缺点的BALB/cnude及T，B缺点的小鼠）右后臀皮下，观看其生长;取实验和相应的正常鼠脾细胞进行细胞毒杀伤实验.结果BALB/c和CBA/N小鼠不成瘤;BALB/cnude和小鼠100%成瘤;SCID免疫重建组用BALB/c外周淋巴细胞重建SCID（BALB/c-PBL-SCID）的不成瘤，用CBA/N外周淋巴细胞重建的SCID（CBA/N-PBL-SCID）成瘤，接种过瘤的BALB/c和CBA/N小鼠脾细胞对癌细胞有较强的细胞毒杀伤作用，对照组和nude，SCID小鼠无杀伤作用;SCID免疫重建有较小的杀伤作用.结论T细胞在异种瘤移植排斥中起要紧的免疫杀伤作用，这种排斥是异种特异性的;肿瘤免疫需要综合性免疫作用.

　　Keywords:

hepatocarcinomacell;vaccination;immunodefi-cientmice;Tlymphocytes;cytotoxicity;flowcytometry

　　Abstract:

AIMToexploretheeffectofimmunecellsinvar-iousmicewithdifferentimmuneongrowthofhumanhepato-carcinomacellsinthesemiceandxenospecificcytotoxicityofthesemicetohepatocarcinomaThehu-manhepatocarcinomacellsculturedwereinoculatedsubcuta-neousintotheposteriorlimbsinvariousmicewithdifferentimmune（includingnormalimmunemice-BALB/c，Blympho-cytedeficientmice-CBA/N，Tlymphocytedeficientmice-BALB/cnudeandT，Blymphocytescombineddeficient）andtheirgrowthinthesurveyedAndthespleencellswereharvestedfrombothexperimentgroupsin5weeksafterbeinginoculatedandfromcontrolgroupsatoexaminedirectcytotoxicitytothehepatocarci-nomaTherewerenocarcinomagrowthinBALB/c，CBA/NmiceandimmunoreconstructedSCIDmicewithBALB/cmiceperipheralbloodlymphocytes（BALB/c-PBL-SCID）but100%carcinomagrowthinSICD，nudeandimmunoreconstructedSCIDmicewithCBA/Nmiceperipher-albloodlymphocytes（CBA/N-PBL-SCID）.AndthespleencellsinexperimentgroupsofBALB/candCBA/Nmicedis-playedstrongcytotoxicitytotargetcellsandthelymphocytesofimmunoreconstructedSCIDmicegeneratedalittlelysisoftargetcells，butthoseofcontrolgroupsandnude，SCIDmicegeneratednolysisoftargetTlympho-cyteswhicharexenospecificcytotoxicmayplayamainroleofimmunekillinginrejectiontoxenograftedtumorbutthecom-prehensiveimmunemaybenecessaryinthetumorimmunity.

　　0引言

　　肝癌是严峻威协人类生命的要紧肿瘤之一，因此对肝癌的研究十分重要.肝癌的医治除初期诊断切除、介入导向、化疗、放疗外，免疫医治及其基础研究仍十分重要［1］.细胞免疫对肿瘤的排斥占有极为重要的地位，其中CD4+和CD8+淋巴细胞都能识别肿瘤细胞，而CD8+通过溶解作用能直接杀伤许多肿瘤，因此是抗肿瘤的要紧效应细胞［2］.CD4+，CD8+及NK细胞在同源肿瘤移植排斥中的研究有重要的意义［3，4］，异种特异性T细胞对肿瘤排斥作用的研究也占有重要的地位［5，6］.咱们通过将人类肝癌细胞系9724培育后接种到不同免疫力小鼠体内，观看肿瘤生长的不同性，测定CD4+，CD8+百分比例及细胞毒杀伤性，探讨免疫细胞对肿瘤生长的阻碍.

　　1材料和方式

　　材料

　　本中心成立的人类原发肝癌细胞系（HCC-9724）［7］用含100mLL-1小牛血清，10万UL-1青霉素和10万UL-1链霉素的RPMI1640完全培育液置37℃，50mLL-1CO2孵箱中培育，到必然数量的对数生长期时，用L-1胰酶（含2mgL-1的EDTA）消化、离心、调整细胞数后接种到小鼠上.BALB/c小鼠15只，CBA/N鼠15只，BALB/cnude5只，皆为本中心繁衍的近交系或突变系实验小鼠，体质量18～22g，6～8周龄，雌雄兼用.其中CBA/N，BALB/cnude小鼠三级实验动物BALB/c为二级动物.小鼠15只从解放军军事医学科学院动物中心提供的三级实验动物，体质量15～18g，5～8周龄，用ELASA法检测无“渗漏”现象.全数实验小鼠都饲养在无特定病原体（SPF）条件中.

　　方式

　　BALB/c和CBA/N各分为2组皮下组，用于不同癌细胞数量的接种;BALB/cnude鼠和SCID只有一组皮下，每组5只.另外BALB/c和CBA/N各5只别离用于重建SCID小鼠免疫.在无菌条件下操作，摘除小鼠眼球取血，常规Ficoll密度法分离淋巴细胞，用RPMI1640洗涤两次（1500rmin

-1，10min），从头用RPMI1640悬浮，取1滴悬液与1滴2gL-1台盼蓝染液混合，于计数板上计数活细胞，调整细胞数2×1010L-1，于接种瘤细胞3d前给SCID小鼠.以癌细胞3×1010L-1接种各小鼠右后肢臀部皮下（包括SICD免疫重建组）.因BALB/c和CBA/N小鼠没成瘤，又以1×1011L-1接种这两种小鼠右后肢臀部皮下小鼠在接种瘤细胞前别离称重，各鼠接种癌细胞1wk后开始，每wk同一时刻进SPF楼，观看肿瘤生长情形，长出瘤体用游标卡尺测量，体积依照公式V=ab2/2（a-短径，b-长径）计算［2］，同时，SCID小鼠每wk称质量.5wk后处死，称瘤体质量.

　　小鼠脾细胞毒杀伤功能检测

　　鼠经脱颈处死，用750mLL-1乙醇浸泡，在超净台中无菌取脾脏，研磨制成脾细胞悬液，洗涤后用100mLL-1FCSRPMI1640调整1×1010L-1，内加高剂量IL-2（10万UL-1）和经5Gy照射的肝癌细胞（1×109L-1），加到24孔培育板中，于50mLL-1CO2孵箱中培育诱导5d.取对数生长期的癌细胞1×109L-1，加N512CrO4于37℃孵育3h（每15min轻轻振

摇1次），掏出用100mLL-1FCSRPMI1640洗涤3次（800rmin-1，5min）从头悬浮，调整细胞数加入96孔培育板（每孔100μL含1×104细胞），同时每孔加100μL不同浓度的效应细胞，每份3个复孔，效靶比例为1001，501，251，1.最大释放组加入10gL-1TritonX-100100μL，自然释放组加100μL的完全培育液，在37℃CO2孵箱中培育4h.然后每孔取上清液100μL，于γ计数仪上测定cpm值，计算:

特异性杀伤率（%）=（实验释放min-1-自然释放min-1）/（最大释放min-1-自然释放min-1）.

　　CD4+和CD8+T细胞百分率测定以3×1010L-1接种的CBA/N和BALB/c及正常相应鼠5wk后取血，置抗凝管中，用FITC标记的抗CD4+和CD8+抗体与全血混匀，室温下放置15min后，用Qprep自动细胞制备仪，加A，B，C液溶解红细胞和稳固淋巴细胞，再用PBS洗细胞1次，轻轻荡，当即上FCM（美国Coullter公司ProfileⅡ型）检测，于波长488nm计数1×10

4个淋巴细胞中各标记的T细胞数分数［8，9］.

　　2结果

　　小鼠癌体生长

　　以3×1010L-1接种小鼠皮下后，BALB/c和CBA/N鼠没显现癌细胞结节，而nude，SCID成瘤率达100%，且都随时刻而增大;两种免疫重建SCID小鼠也有不同的癌结节表现，BALB/c-PBL-SCID癌结节到5wk全数消失，CBA/N-PBL-SCID3wk以后有慢慢缩小的现象（Fig1（略））.

最后所称的癌体质量均值为SCID组>nude组（P<），SCID和nude组>CBA/N-PBL-SCID组（皆为P<）.当用1×1011L-1癌细胞数接种到CBA/N小鼠后，显现癌体一时性增大，5wk时全数消失（Fig1（略））.还有另一现象，SCID小鼠的体质量随瘤体积增大而减小（Fig2（略），nude没有称质量），SCID和BALB/c-PBL-SCID小鼠癌体的大小与其各自体质量呈负线性关系（别离为r=，P<和r=，P<）.CBA/N-PBL-SCID癌体大小与其体质量没明显的负线性不同，但存在背离现象.

　　细胞毒对肿瘤的杀伤

　　BALB/c和CBA/N的脾细胞对肝癌细胞系9724的杀伤成心义，在效靶比例1001时，前者为（±）%，后者为（±）%（自然释放率约为%）.CBA/N-PBL-SCID为（±）%，BALB/c-PBL-SCID为（±）%.SCID和nude小鼠只有微小的杀伤作用（Fig3（略））.不同小鼠的不同效靶比例对癌细胞杀伤线图如Fig4所示.相应付照鼠脾细胞进行实验时不产生杀伤效应.

　　CD4+和CD8+T细胞正常CBA/N小鼠的CD4+和CD8+数分数高于BALB/c，其中两组CD

4+之间有不同，CD4+/CD8+正常，接种肿瘤后发生转变（Tab1）.表1CBA/N和BABL/c小鼠CD（略）

3讨论

　　在肿瘤免疫中，以为T细胞起着最重要的作用，NK细胞在抗肿瘤及抗转移中起着不可轻忽的作用［3，4，10］.从肝癌细胞接种到4种小鼠所建模型看，具有T，B，NK三大免疫细胞的BALB/c小鼠排斥肿瘤最强;有T，NK细胞而B细胞缺乏的CBA/N小鼠排斥力仍很强，但随接种瘤细胞量增加，显现癌体增大又慢慢缩小至消退的现象.可见B淋巴细胞缺乏的CBA/N小鼠，排斥力仍强，然有所下降.尽管nude鼠有B淋巴细胞和NK细胞，由于缺乏T细胞已无法阻止肿瘤进行性生长增大.SCID小鼠是一种严峻联合免疫（T，B细胞）缺点小鼠，NK细胞有所增高［11］.本实验并没象文献［3，10］报导的那样NK有较强的排斥肿瘤作用，而是SCID瘤体比nude鼠癌体长得更快.免疫重建SCID小鼠的移植癌体的生长曲线说明免疫重建是成功的，也更证明了BALB/c和CBA/N免疫排斥肿瘤的特点.因此可推测，单独NK或B淋巴细胞的存在，或NK和B细胞同时存在都无法阻止肿瘤的生长，T细胞对肿瘤的排斥起最重要的作用，但并非B淋巴细胞和NK细胞不起作用.本组细胞毒杀伤实验大体符合小鼠免疫特点，更进步证明T细胞在肿瘤中的作用.正常CBA/N的CD4+和CD8+T细胞百分率比BALB/c中的含量高，而本组CBA/N的脾细胞杀伤能力也高于BALB/c，这与T细胞毒是一致的，也与另一文论述相一致［5］.BALB/c和CBA/N免疫重建SCID小鼠其细胞毒杀伤力较小，且前者高于后者，说明这一免疫重建是真实的，也符合该小鼠免疫特点，因为咱们是通过ip进行免疫重建的.nude和SCID有微小的杀伤力并非能说结果与理论相矛盾，因诱导进程可激活NK至LAK细胞起到杀伤作用.非接种肿瘤4种小鼠脾细胞实验时无细胞毒杀伤力，这说明T细胞毒是特异性的.另一问题是CBA/N中的T细胞百分率及杀伤力都比BALB/c高，而BALB/c对肿瘤的排斥力那么大于CBA/N;nude鼠中B淋巴细胞的存在却对肿瘤没显现明显的抑制.因此，综合几种小鼠对肿瘤的排斥性及细胞毒性作用，能够如此以为T细胞在直接杀伤肿瘤中起要紧的作用，B淋巴和NK细胞也有排斥作用，但各类淋巴细胞和NK细胞不是简单的相加或相减，可能他们之间还存在着一种协同增进的作用;相反，一旦有一种缺乏，就会阻碍另一种细胞应有的作用.但也并非象有的作者以为，T细胞在抗肿瘤作历时，必需有一起刺激分子（如B7-1）的存在［12］，本文结果显示T细胞和B细胞都能单独发挥杀伤肿瘤的效应，可能是非B淋巴细胞依托性T细胞杀伤作用或非T细胞依托性的B淋巴细胞抗肿瘤.

　　那么T细胞对人类肝癌细胞的杀伤是特异性的免疫防御作用仍是异种排斥作用?

Sandrin等

［13］以为异种移植的急性或超急性排斥反映要紧由抗体和补体介导引发的;尽管，淋巴细胞介导的细胞毒也参与异种移植非急性排斥反映，但要紧由CD4+和NK细胞引发［14，15］.具有穿孔素通路细胞毒的小鼠（如CBA/N，BALB/c等）针对人类肿瘤引发的细胞毒杀伤要紧由异种特异性CD8+细胞介导的，是异种特异性T淋巴细胞的特异性免疫反映［4］.本文接种癌细

胞和非接种癌细胞的细胞毒杀伤实验及肿瘤接种后CD4+，CD8+的细胞含量的转变都证明T细胞毒的杀伤是异种特异性细胞毒免疫反映，也可推测是要紧由CD8+细胞介导的，CD4+起辅助作用.

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