滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析.docx

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滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

　　摘要：

根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物，使用逆转录PCR（RT-PCR）技术从滇龙胆幼叶扩增该基因，并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。

结果表明：

GrAACT基因（登录号KJ917163）开放阅读框长1215bp，编码404个氨基酸；GrAACT蛋白相对分子质量41.41ku，pI值为6.25，属于AACT蛋白家族成员，无信号肽，为疏水稳定蛋白，主要由α-螺旋、无规则卷曲构成；GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域：

硫解酶N端结构域（第12～272位氨基酸）、硫解酶C端结构域（第282～402位氨基酸）、类硫解酶结构域（第13～403位氨基酸）；在硫解酶C端结构域中，包含硫解酶保守位点（第350～366位氨基酸）、硫解酶活性位点（第385～398位氨基酸）；滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近；GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为6741ku；组织特异性表达分析结果表明，GrAACT基因主要在茎、根中表达。

　　关键词：

滇龙胆；乙酰CoA酰基转移酶；基因克隆；生物信息学分析；表达分析

　　中图分类号：

S184；R282.71；Q785文献标志码：

A文章编号：

1002-1302（2016）06-0094-05

　　收稿日期：

2015-05-27

　　基金项目：

国家自然科学基金（编号：

81260608）；国家科技支撑计划（编号：

2011BAI13B02-04）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（编号：

2015Z171）。

　　作者简介：

张晓东（1980―），男，河南新郑人，博士，副教授，从事植物代谢基因工程研究。

E-mail：

zxd95@。

　　通信作者：

王元忠，硕士，助理研究员，从事药用植物资源评价与利用的研究。

E-mail：

boletus@。

滇龙胆是传统中药龙胆的来源植物之一，也是云南省重要道地药材，主要分布于中国西南部，尤其是云南省山区地带；其根入药，用于治疗各种炎症、肝炎、风湿病和胆囊炎等[1]。

目前，医用龙胆需求量每年递增约10%，而现有滇龙胆产量低、品质不高，且野生滇龙胆资源遭到人为大肆采挖[2]。

为选育优质、高产、高抗新品种，2013年6月云南省已启动龙胆草航天育种工程[3]。

从中医药现代化角度来看，滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷，要从根本上解决龙胆草药源问题并保护野生滇龙胆，除筛选新品种之外，还必须弄清龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理，为通过基因工程手段生产龙胆苦苷奠定基础。

　　龙胆苦苷为裂环烯醚萜类化合物，在植物中主要通过质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）、胞质甲羟戊酸（MVA）途径合成[4]。

乙酰CoA酰基转移酶（又称乙酰乙酰CoA硫解酶，AACT，EC2.3.1.9）是MVA途径中的第1个限速酶，能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[5]。

目前，乙酰CoA酰基转移酶基因AACT已从拟南芥[5]、丹参[6]、胡萝卜[7]、白木香[8]、油茶[9]等许多植物中分离。

AACT基因表达具有组织特异性，并被生物、非生物因素诱导。

拟南芥中存在2个平行进化的同源基因，其中AtAACT1主要在维管系统中表达，AtAACT2则在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达，二者存在功能冗余；AtAACT2的作用是为胞质定位、MVA起源的异戊烯萜类生物合成途径合成大量乙酰乙酰CoA前体[5]。

在生物诱导剂（100mg/mL酵母提取物）、非生物诱导剂（30mmol/LAg+）共同诱导下，丹参SmAACT基因在诱导后12h的表达量达到最高值[10]。

　　目前，由于龙胆基因组资源极度匮乏[11]，导致龙胆苦苷生物合成途径并不清楚[3]。

本研究根据笔者实验室滇龙胆转录组数据库中的GrAACT基因序列，设计特异性引物，通过逆转录PCR（RT-PCR）技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到GrAACT基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为阐明滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　滇龙胆组培苗、盆栽苗均采自玉溪师范学院分子生物学实验室，经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆（GentianarigescensFranch.exHemsl）。

基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所用材料为盆栽3年生滇龙胆的根、茎、叶，采样日期为2014年5月17日。

　　1.2方法

　　按照多糖植物组织提取试剂RNAiso（TaKaRa，大连）说明书提取滇龙胆幼叶总RNA；按照逆转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成cDNA。

根据原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点和笔者所在实验室前期测序的滇龙胆转录组GrAACT基因序列，设计1对特异引物GrAACTBamHⅠ-F、GrAACTXhoⅠ-R（表1）。

以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：

0.5μLTransTaqTaqDNAPolymeraseHighFidelity（2.5U/μL，北京全式金生物技术有限公司），5μL10×TransTaqHiFiBufferⅡ，4μLdNTP（2.5mmol/L，TaKaRa，大连），2μL模板，各1μL正反向引物（10μmol/L），加ddH2O补足至50μL。

PCR反应条件为：

94℃3min；94℃30s，55.5℃30s，72℃75s，30个循环；72℃10min。

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后割胶，使用胶回收试剂盒（Qiagen，德国）对目的片段进行回收，将其连接到pMD19-T载体（TaKaRa，大连）。

转化大肠杆菌DH5α（TaKaRa，大连）后进行蓝白斑筛选，挑取12个白斑摇菌；使用试剂盒提取质粒（北京百泰克生物技术有限公司），经酶切检测正确后进行测序[生工生物工程（上海）股份有限公司]，获得重组质粒pMD19-GrAACT。

　　1.2.1GrAACT基因的生物信息学分析用NCBI网站的BLAST程序进行序列比对，用Genetyx6.1.8进行翻译，用DNAMAN7进行多序列比对，用ClustalX2.1进行比对，然后用MEGA6.0软件内置的NJ法构建系统进化树，设置Bootstrap=1000；利用在线数据库（http：

//molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html）进行稀有密码子分析。

用ChloroP服务器v1.1进行叶绿体转运肽预测；用Interpro软件进行保守结构域预测；用ProtScalee软件进行疏水性分析；用PredictProtein对二级结构进行预测；用Phyre2（http：

//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？

id=index）对三级结构进行预测；用Expasy中的TMHMM工具预测蛋白的跨膜螺旋区；用在线工具WOLFPSORT预测蛋白的亚细胞定位情况。

　　1.2.2GrAACT基因的荧光实时定量分析分别取3年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总RNA，用DNaseI处理除去基因组DNA。

用反转录试剂盒（TaKaRa）合成第1链cDNA。

以转录组中GrGAPDH基因（GenBank登录号KM061807）作为内参设计特异性引物（表1），PCR条件：

95℃3min，95℃15s，60℃31s。

根据GrAACT基因开放阅读柜（ORF）序列设计特异性引物（表1），使用SuperRealPreMixPlus试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]进行qPCR，扩增条件为：

95℃3min，95℃15s，60℃31s；每个反应重复3次。

反应在ABI7000荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成。

使用内参基因GrGAPDH表达校准后，计算根、茎、叶中GrAACT基因的相对表达量。

采用比较CT值的“2-ΔΔCT”的方法进行定量数据的分析处理。

　　2结果与分析

　　2.1滇龙胆GrAACT基因的克隆

　　以滇龙胆幼叶cDNA为模板，使用表1中的基因特异性引物GrAACTBamHI-F、GrAACTBamHI-R扩增出约1200bp的片段，详见图1。

通过TA克隆获得重组质粒pMD19-GrAACT。

　　2.2GrAACT基因的生物信息学分析

　　2.2.1GrAACT基因的ORF分析和多序列比对分析利用Genetyx软件对GrAACT基因的ORF序列进行分析，结果显示：

该基因（GenBank登录号KJ91716）长1215bp，编码404个氨基酸。

利用GenBank数据库的BLASTp程序对GrAACT蛋白进行比对分析，结果表明：

滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白的序列相似性最高（88.61%），与单子叶植物玉米ZmAACT蛋白的相似性（78.55%）稍低。

利用DNAMAN7将GrAACT蛋白序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明：

GrAACT蛋白与已知蛋白序列相比保守性较高（图2）。

利用Mega6.0将GrAACT氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行系统发育分析，结果显示：

滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白处于同一进化支（图3），表明二者亲缘关系较近。

　　2.2.2GrAACT蛋白的理化特性分析使用ExPASyProtParamtool对GrAACT蛋白进行分析，结果表明：

GrAACT蛋白单体相对分子质量为41410u，pI值为6.25，这与丹参SmAACT蛋白[6]、油茶CoAACT蛋白[9]、拟南芥ATAACT2蛋白[5]类似；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）数为36个，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）数为38个，化学式为：

C1812H2959N509O562S17；不稳定指数为27.92，属稳定蛋白；脂肪指数为9856，总平均疏水性（GRAVY）为0.178，为疏水蛋白（图4）。

GrAACT蛋白含20种基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，为13.9%；其次是甘氨酸、缬氨酸，含量分别为11.9%、9.9%；色氨酸含量最低，为0.5%。

　　2.2.3GrAACT蛋白的二级结构、三级结构分析利用SSpro方法对GrAACT蛋白进行二级结构分析，结果表明：

该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占39.11%，无规则卷曲（C）占40.10%，延伸带（E）占20.79%。

利用Swiss-ModelWorkspace的自动模式预测GrAACT蛋白的三级结构，结果见图5，该模型以人线粒体乙酰CoA酰基转移酶[2f2s.1.C]为模板，在第13―404位氨基酸处建模，序列相似度为52.73%。

　　2.2.4GrAACT蛋白保守结构域分析使用InterPro在线工具对GrAACT蛋白的保守结构域进行分析，结果表明：

GrAACT

　　蛋白包含3个保守结构域，它们分别为硫解酶N端结构域（IPR020616，第12―272位氨基酸）、硫解酶C端结构域（IPR020617，第282―402位氨基酸）、类硫解酶结构域（IPR016039，第13―403位氨基酸）（图6）。

在硫解酶C端结构域中，包含硫解酶保守位点（THIOLASE_2，第350―366位氨基酸）、硫解酶活性位点（THIOLASE_3，第385―398位氨基酸）。

　　2.2.5GrAACT蛋白信号肽分析利用ExPASySignalP4.1服务器分析GrAACT蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。

利用TMHMM工具预测GrA