三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨.docx
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三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨
三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
作者:
马陶陶张群林李俊孟晓明黄成陈玉璞【摘要】 目的探讨以芦丁作为对照品,采用三氯化铝(AlCl3)比色法测定中药总黄酮含量的专属性,并建立AlCl3比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。
方法通过对几类典型结构的黄酮类及多酚类化合物AlCl3显色前后的吸收峰(200~600nm)进行比较,分析以芦丁为对照品的AlCl3比色法测定中药总黄酮的合理性。
结果AlCl3显色后,部分黄酮类物质在421nm处有较强吸收。
结论采用AlCl3比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性,并建立了AlCl3比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。
【关键词】AlCl3比色法总黄酮芦丁 Abstract:
ObjectiveTodiscussthespecialityofAlCl3colorimetrywithrutinasreferencesubstanceforevaluationonthecontentoftotalflavonoidsandinvestigatetheoptimumconditionofAlCl3colorimetry.MethodsTomakeaseriesofflavonoidsandpolyphenolswithtypicalstructurewithAlCl3andmeasuretheirabsorptioncurvesattherangeof200~600nm.ResultsAtthewavelengthof421nm,someflavonoid-likecompoundsshowedthesimilarabsorptionwithrutin.ConclusionItisreasonabletodeterminethetotalflavonoidsbyusingAlCl3colorimetrywithrutinasreferencesubstanceandestablishtheoptimumconditionofAlCl3colorimetry. Keywords:
AlC3colorimetry;Totalflavonoids;Rutin 黄酮类化合物(Flavonoids)是以C6-C3-C6结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物,以其广泛的药理作用倍受青睐,而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。
中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色谱法等[1]。
比色法是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法,其中又以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法常用[2]。
这种方法以NaNO2-Al(NO3)3为显色剂,在碱性条件下,利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征,以芦丁为对照,在510nm处测定吸光度,从而得到待测物质总黄酮的含量。
郭亚建等[3]曾对这种方法的专属性进行了讨论,发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处(510nm左右)也有较强吸收,而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收,从而说明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以芦丁作为对照,不能排除非黄酮类物质的干扰,这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。
因此,本实验采用另一种常用的比色法:
AlCl3比色法,对几类典型结构的黄酮类化合物(芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷)及多酚类化合物(2,3-二羟基苯甲酸,绿原酸,和厚朴酚,阿魏酸)AlCl3显色前后的吸收峰(200~600nm)进行比较,分析以芦丁为对照品的AlCl3比色法测定中药总黄酮的合理性,并对芦丁显色的pH值,AlCl3浓度、显色温度等条件进行优化研究。
1仪器与试药 Agilent8453紫外分光光度计;PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)。
试剂:
芦丁,葛根素,2,3-二羟基苯甲酸,绿原酸,和厚朴酚,阿魏酸,儿茶素,木犀草素,异鼠李素,山柰奈酚,槲皮素,金丝桃苷,蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所。
三氯化铝,醋酸钠,冰醋酸,甲醇均为分析纯,水为双蒸水。
2方法 2.1供试品的制备以芦丁为例,精密称取芦丁标准品(120℃烘干至恒重)10.0mg,甲醇定容至50ml,配成0.2mg/ml的芦丁母液。
2.2显色试剂的配置精密称取AlCl31.34g,甲醇定容至100ml,配成0.1mol/L的溶液。
精密称取CH3COONa·3H2O2.72g,双蒸水溶解至100ml,配成0.2mol/L的溶液。
精密量取1.15ml冰醋酸,双蒸水稀释至100ml配成0.2mol/L的醋酸溶液[4,5]。
2.3芦丁紫外吸收峰的扫描精密量取1ml芦丁母液溶液,置于10ml容量瓶,加入2ml0.1mol/L的AlCl3溶液,甲醇定容,充分显色20min[6],在200~600nm范围扫描,记录吸光度值。
2.4供试品紫外吸收峰的扫描精密量取1ml供试品(芦丁,葛根素,2,3-二羟基苯甲酸、绿原酸、阿魏酸、和厚朴酚、儿茶素、木犀草素、异鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金丝桃苷、蒙花苷、橙皮苷),按“2.3”项下方法,在200~600nm扫描样品的紫外吸收峰。
2.5标准曲线及可行性考察从芦丁母液中精密移取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml溶液,平行两份,第1份直接加入2ml0.1mol/L的AlCl3显色20min;第2份加入2ml0.1mol/LAlCl3,1mlpH为5.2的NaAC-HAC缓冲溶液,40℃水浴显色10min,分别做标准曲线,并以金丝桃苷为样品,考察方法的可行性。
3结果 3.1芦丁显色的紫外光谱图在黄酮类化合物的紫外光谱图上,主要有苯甲酰基部分引起的吸收带I(300~400nm)和桂皮酰基部分引起的吸收带II(240~280nm),加人铝盐可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物,带I红移,吸光度明显增大。
当加入AlCl3充分显色后,芦丁吸收峰从359nm红移至421nm,且吸光度有所增加。
见图1。
图1芦丁加入AlCl3前后的紫外光谱图(略) 3.2AlCl3比色法专属性探讨在200~600nm对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质AlCl3显色前后的紫外吸收峰进行比较,结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈酚的吸收峰位置和芦丁的相似,都在421nm左右,而其他物质的与芦丁的不同。
如图2为显色后各物质的紫外光谱图。
图214种物质显色后的紫外光谱图(略) 3.3显色条件的优化 3.3.1pH值的影响采用NaAc-HAc缓冲盐溶液调节溶液的pH值,实验表明,当缓冲盐的pH值小于5.2时,芦丁的吸收峰在402nm左右,且吸光度值较小;当pH值在5.2~6.0时,吸收峰在421nm左右,吸光度值增大,如图3(a)。
且当pH值为5.2时,吸光度值最大,因此选择pH为5.2的NaAc-HAc缓冲盐体系作为优化的显色条件之一。
3.3.2AlCl3的浓度以2×10-5g/ml的芦丁溶液,pH值5.2的NaAc-HAc缓冲盐为条件,在6.6×10-5~0.33mol/L范围内讨论AlCl3浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响,结果发现:
1∶600≤n芦丁:
nAlCl3≤1∶2时,即AlCl3浓度为3.3×10-4~0.1mol/L时,吸收峰在421nm左右,且吸光度的值随AlCl3浓度的增加而变大。
如图3(b)所示。
n芦丁:
nAlCl3>1:
2,即AlCl3浓度小于3.3×10-4mol/L时,吸收峰在365nm左右,且吸光度减小。
n芦丁:
nAlCl3<1:
600,即AlCl3浓度大于0.1mol/L,吸收峰移至404nm左右,且吸光度减小。
因此选择AlCl3浓度为0.1mol/L为芦丁显色的优化条件之一。
3.3.3显色温度对吸光度的影响实验中由于显色时间较长,为了提高效率,采用水浴加热。
加热10min,考察水浴温度对吸收峰位置及吸光度大小的影响。
如图3(c)。
结果表明,水浴温度40℃是芦丁显色的优化条件之一。
图3显色条件对芦丁吸光度的影响(略) 3.4显色稳定性考察以2×10-5g/ml芦丁溶液,0.1mol/LAlCl3,pH值5.2NaAc-HAc缓冲溶液为条件,考察显色的稳定性,结果表明,显色150min,吸光度变化的RSD为2.862%,说明以芦丁为对照,AlCl3比色法显色稳定。
3.5线性及可行性考察以一定浓度的金丝桃苷作为样品,直接加入2ml0.1mol/L的AlCl3,显色20min,其标准方程:
Y=0.00779+27351.19048X,RA=0.99922,测得的金丝桃苷的浓度是2.75×10-4g/ml,回收率为121.15%;而优化后的方法:
2ml0.1mol/LAlCl3,1mlpH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液,40℃水浴显色10min,其线性方程为Y=0.00153+29595.20932X,RB=0.99972,测得的金丝桃苷浓度为2.306×10-4g/ml,回收率为101.58%。
由此说明0.1mol/LAlCl3,pH5.2的NaAc-HAc缓冲盐溶液,40℃水浴显色10min,方法的准确度更高,为AlCl3比色法的优化方法。
4讨论 葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入AlCl3,反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变,而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。
从结构上分析,葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5位羟基,不存在邻二酚羟基和3位羟基,由此可见AlCl3的显色反应主要发生在3位羟基、4位羰基和邻二酚羟基,只存在5位羟基、4位羰基时黄酮类物质与AlCl3不发生反应。
芦丁与AlCl3发生显色反应,生成黄色络合物,在421nm左右有较强吸收。
实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描,结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物:
2,3-二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸,AlCl3显色前后在421nm左右均没有吸收峰,消除了非黄酮类化合物对显色的干扰。
槲皮素为芦丁的苷元,显色后在437nm左右有较大吸收,而芦丁的最大吸收峰在421nm,说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大,槲皮素3位羟基可能对反应有影响。
木犀草素的结构和芦丁相比,3位没有羟基,显色后在414nm有最大吸收,从而进一步说明3位羟基可能对AlCl3显色反应有影响。
具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元:
金丝桃苷,芦丁,异鼠李素,山柰奈酚,AlCl3显色前在421nm处无吸收,显色后均在芦丁的最大吸收峰421nm左右有较大的吸收。
在现今的实验条件下,对于大多数黄酮类中药材而言,多含有黄酮苷,常见的苷在此波长处有较强吸收,而非黄酮类物质在此处无吸收。
因此以芦丁作为对照,AlCl3比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。
对于任一络合反应,溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式,影响络合物的组成。
当采用盐酸(氢氧化钠)调节显色溶液pH值时,因其酸(碱)性较强,破坏络合物的结构,无法测得中药总黄酮含量的真实值,而采用NaAc-HAc缓冲盐溶液时,加入前后芦丁的吸收峰位置不变,仍在359nm处,所以采用NaAc-HAc缓冲盐调节显色溶液的pH值。
从方法的可行性考察结果可以看出,以金丝桃苷为样品,采用2种方法考察回收率,优化的方法准确度更高,所以加入0.1mol/LAlCl3,pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液,40℃水浴加热10min为AlCl3比色法的优化显色条件。
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