学年人教版选修1 专题5 第14课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段 学案.docx
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学年人教版选修1专题5第14课时多聚酶链式反应扩增DNA片段学案
第14课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段
[学习导航] 1.阅读教材P58“
(一)”,分析PCR技术与DNA复制的区别和联系,掌握PCR技术原理。
2.阅读教材P59“
(二)”,分析PCR的过程,掌握PCR循环的原理。
3.阅读教材P62“实验操作”及“操作提示”,掌握PCR技术的实验操作过程及注意事项。
4.阅读教材P62~63“结果分析与评价”,掌握DNA含量测定的方法。
[重难点击] 1.了解PCR技术的基本操作。
2.理解PCR的原理。
3.讨论PCR的应用。
一、PCR原理与反应过程
1.PCR原理与条件
(1)PCR的概念
PCR即多聚酶链式反应,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)细胞内DNA复制的基本条件
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(3)PCR原理
①DNA变性:
在80~100℃的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。
②DNA复性:
当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链,这个过程称为复性。
③子链的合成:
DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(4)PCR条件
①原料:
4种脱氧核苷酸。
②模板:
加热变性解旋后的两条DNA母链。
③酶:
耐热的DNA聚合酶。
④引物:
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
⑤其他条件:
需要稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的温控设备等。
2.PCR过程与结果
(1)PCR过程
过程
温度
主要变化
变性
90℃以上
双链DNA解聚为单链
复性
50℃左右
两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合
延伸
72℃左右
溶液中的四种脱氧核苷酸(A,T,G,C)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(2)PCR的结果
DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。
1.PCR原理
PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同?
请分析原因。
答案 不相同。
体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA,但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。
2.PCR反应过程
(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗?
若需要,则与细胞内DNA复制有何区别?
答案 PCR反应不需要解旋酶,但需要DNA聚合酶。
由于PCR反应中需要高温使DNA解旋,因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。
(2)PCR的每次循环中应如何控制温度?
请分析原因。
答案 每次循环中先高温解旋,再低温使引物与模板结合,最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。
(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的?
答案 DNA的羟基(—OH)末端为3′端;磷酸基团的末端为5′端。
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
归纳总结
PCR扩增与DNA复制的异同
项目
DNA复制
PCR扩增
不
同
点
时期
有丝分裂间期或减Ⅰ前的间期
任何时期
场所
活细胞内
细胞外
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的TaqDNA聚合酶
引物
有转录,产生RNA作引物,无需人工加入
无转录,无引物产生,需人工加入两种DNA引物
特点
边解旋边复制
先全部解旋后开始复制
缓冲液
不需缓冲液
配制缓冲液代替细胞核液
设备
无
控制温度变化的温控设备
相
同
点
原理
严格遵循碱基互补配对原则
引物
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
模板
DNA的两条链为模板
特点
半保留复制
原料
游离的四种脱氧核苷酸
1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中,正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
答案 C
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,故DNA复制需要引物。
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链,而不能从5′端延伸DNA链。
引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。
PCR扩增的对象是DNA,不是氨基酸序列。
2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题,而被广泛应用,与细胞内的DNA复制相比,PCR可以快速扩增所需的DNA片段,请分析回答下列有关问题:
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA,而PCR技术中的解旋原理是______。
(2)此过程需要一种TaqDNA聚合酶。
该酶是从____________________中分离的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶具有的特性是______________。
(4)与体内DNA复制相比较,PCR反应要在______________中才能进行,并且要严格控制________条件。
(5)PCR中加入的引物有________种,加入引物的作用是__________________________。
答案
(1)DNA的热变性原理
(2)水生耐热细菌Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为DNA复制的起点
解析
(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开,从而解旋,其原理是DNA的热变性原理。
(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性,具有耐高温的特性。
(4)PCR反应需要适宜的温度和pH,因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行,并需严格控制好温度条件。
(5)PCR需要两种引物,引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。
PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA,作用是引导DNA复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点。
一题多变
细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗?
若需要,是如何实现的?
答案 需要。
细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关,低等生物与环境因素有关。
易错提醒
与PCR原理有关的三个易错点
(1)酶的作用位点:
解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开;DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。
不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶和DNA连接酶:
DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上,需要模板;而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。
(3)PCR中的解旋过程:
PCR过程中不需要解旋酶,需要升高温度才能打开氢键,但此时的温度不会破坏磷酸二酯键,因此,DNA加热变性后变为单链,并未分解成单体。
二、PCR的实验操作
1.实验用具
名称
作用
PCR仪
自动调控温度,实现DNA的扩增
微量离心管
实际上是进行PCR反应的场所
微量移液器
用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每吸取一种试剂后,其上的枪头都必须更换
2.实验步骤
准备:
按照PCR反应需要的物质和条件,将需要的试剂和仪器准备好
↓
移液:
用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各试剂
↓
混合:
盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀
↓
离心:
将微量离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在离心管底部
↓
反应:
将离心管放入PCR仪中进行反应
3.DNA含量的测定
(1)测定原理:
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA含量有关。
(2)计算方法:
DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数。
1.实验过程分析
(1)离心的目的是什么?
在离心的过程中,微量离心管的盖子为什么一定要盖严?
答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效率。
微量离心管的盖子一定要盖严,防止实验中脱落或液体外溢。
(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁,目的是什么?
答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁的目的是使反应液混合均匀。
(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌,为什么这样操作?
还有哪些操作与此目的相同?
答案 为避免外源DNA等的污染。
在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
2.结果检测
(1)实验中为什么要测定DNA的含量?
答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量,所以需要对DNA含量进行测定。
(2)如何判断DNA扩增成功?
答案 ①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
②电泳检测的方法,可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果?
答案 样品产物少,或产生新的DNA。
3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④①B.①⑤③②④
C.②③⑤①④D.④②⑤③①
答案 C
解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―→离心―→反应。
PCR仪是一种自动控制温度的仪器,设计好循环程序就可以进行反应了。
4.近20年来,PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段,其原理是利用DNA半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图),在短时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链间的________键完全打开,称为____________;而在细胞中是在____________酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段,应该加入________种特定的引物。
当温度降低至55℃时,引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合,在DNA聚合酶的作用下,只能在引物的_______端连接脱氧核苷酸,两条子链的延伸方向都是_________。
(3)PCR技术的必需条件,除了模板、原料、酶之外,至少还有三个条件,即液体环境、适宜的______和________,前者由________自动调控,后者则靠__________来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制,如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中,以14N标记的脱氧核苷酸为原料,连续复制四次之后,则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
答案
(1)氢 解旋 解旋
(2)两 3′ 从子链的5′端向3′端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR仪 缓冲液 (4)1/8
解析
(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂,称为解旋,而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。
(2)PCR分为三个基本反应步骤:
变性(95℃)、复性(55℃)、延伸(72℃),其特异性依赖于与靶序列互补的引物,引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段,两引物之间的距离决定扩增片段的长度。
由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3′端延伸DNA链,则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同,除了需要模板、原料、酶以外,至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液),每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。
(4)一个DNA分子连续复制四次之后,形成16个DNA分子,15N标记的DNA分子有2个,则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
1.PCR技术最突出的优点是( )
A.原理简单B.原料易找
C.TaqDNA聚合酶具有耐热性D.快速、高效、灵活、易于操作
答案 D
解析 PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活和易于操作。
TaqDNA聚合酶具有耐热性是实验操作成功的关键。
2.符合PCR反应条件的一项是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物 ④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥解旋酶 ⑦限制酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑦⑧D.①②③④⑤⑧
答案 D
解析 PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件,只是无需解旋酶(可热变性),也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。
3.下列关于PCR的描述中,正确的是( )
①PCR是一种酶促反应 ②引物决定了扩增的特异性 ③扩增DNA利用了热变性的原理 ④扩增的对象是氨基酸序列
A.①②④B.②③④
C.①③④D.①②③
答案 D
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,在高温条件下,把DNA的双链打开,缓慢冷却后,又重新结合,需要耐高温的DNA聚合酶,同时,还需要引物,从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
4.下图所示为PCR扩增的产物,请分析此产物是哪次循环的产物( )
A.第一次循环B.第二次循环
C.第三次循环D.第四次循环
答案 A
解析 在PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的DNA中只有一种引物;从第二次循环开始,上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,所以会形成DNA分子两端均含引物的情况,如下图所示,因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
请回答下列问题:
(1)DNA的两条链是反向平行的,通常将____________的末端称为5′端,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题,但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。
到20世纪80年代,科学家从一种Taq细菌中分离到______________________,它的发现和应用解决了上述问题。
要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来,所用的培养基叫____________。
(3)PCR的每次循环可以分为__________________三步。
假设在PCR反应中,只有一个DNA片段作为模板,请计算在5次循环后,反应物中大约有________个这样的DNA片段。
(4)简述PCR技术的主要应用:
________________________________(要求至少答两项)。
答案
(1)磷酸基团 3′端
(2)耐高温的TaqDNA聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32 (4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基,另一端是游离的磷酸基团,含羟基的一端是3′端,含磷酸基团的一端是5′端。
引物的5′端与模板链的3′端结合,然后沿着引物的3′端延伸。
耐高温的TaqDNA聚合酶的发现是实现PCR的关键,该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。
PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。
[基础过关]
1.PCR技术扩增DNA,需要的条件是( )
①目的基因 ②引物 ③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖体
A.②③④⑤B.①②③⑥
C.①②③④D.①③④⑤
答案 C
解析 PCR技术需要目的基因作为扩增的模板,DNA聚合酶催化反应的进行,而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要,四种脱氧核苷酸是该过程的原料,以及一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。
2.下列有关PCR反应的叙述,正确的是( )
A.PCR反应所需要的引物只是RNA
B.PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸
C.PCR反应所需要的酶在60℃会变性
D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
答案 D
解析 PCR反应需要的引物一般是DNA,反应所需要的材料是脱氧核苷酸,PCR所需要的酶是耐高温的,在60℃不会变性。
3.下列各项属于引物作用的是( )
A.打开DNA双链
B.催化合成DNA子链
C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制
D.提供模板
答案 C
解析 DNA分子的复制具有方向性,即只能从子链的5′端→3′端方向进行复制。
当引物与DNA母链结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。
4.PCR一般要经过三十多次循环,从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时( )
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无需与引物结合,在酶的作用下从头合成子链
答案 B
解析 当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时,此单链引物固定端为5′端,因此与它互补的子链应从另一端开始合成,即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。
5.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器,它调控不同温度的目的是( )
①95℃时,使DNA分子变性,磷酸二酯键断开 ②95℃时,使DNA分子变性,解开螺旋 ③55℃时,使DNA分子开始复制、延伸 ④55℃时,引物与DNA单链结合 ⑤72℃时,使DNA分子开始复制、延伸 ⑥72℃时,使DNA分子恢复双螺旋结构,恢复活性
A.①③⑤B.②③⑤C.②④⑤D.②④⑥
答案 C
解析 PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。
当温度上升至95℃时,DNA分子变性,解开双螺旋结构;温度下降到55℃时,引物与DNA单链结合,恢复活性;温度上升至72℃时,DNA分子开始复制、延伸,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
6.下面关于DNA光吸收特点或DNA含量计算的叙述正确的是( )
A.DNA主要吸收蓝紫光
B.DNA主要吸收红橙光
C.可根据DNA在260nm紫外线波段光吸收值的多少推算DNA的含量
D.计算DNA含量的公式可表示为“50×紫外分光光度计260nm的读数”
答案 C
解析 DNA主要吸收波长为260nm的紫外线,可据光吸收量的多少推算DNA的含量,公式可表示为“DNA含量(μg/mL)=50×(紫外分光光度计260nm的读数)×稀释倍数”。
[能力提升]
7.有关下列操作过程的叙述,错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化,而不能迅速融化,即C项错误。
8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物(注:
引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸),两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,如下图乙所示,其中第⑤种DNA分子有几个( )
A.8B.6C.4D.2
答案 A
解析 由图分析可知:
X基因第一次复制得到两个两种DNA分子:
①和②;X基因第二次复制得到四个四种DNA分子:
①复制得①和③、②复制得②和④;X基因第三次复制得到八个五种DNA分子:
①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;X基因第四次复制得到16个五种DNA分子:
①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤复制得到4个⑤。
从上面的推测可知,第四轮循环产物中有8个⑤。
9.在PCR扩增DNA的实验中,预计一个DNA分子经过30次循环后,应该得到230个DNA分子,但是结果只有约210个DNA分子,那么出现该现象的原因不可能是( )
A.TaqDNA聚合酶的活力不够,或活性受到抑制
B.系统设计欠妥
C.循环次数不够
D.引物不能与母链结合
答案 D
解析 如果TaqDNA聚合酶活力不够,或活性受到抑制,则导致催化效率降低,得到的产物比预期的少,A项正确;如果PCR系统设计欠妥,则达不到预期的结果,B项正确;如果循环次数过少,产物的量比预期的少,C项正确;如果引物设计不合理,若不能与模板DNA结合,将造成无法进行扩增,而结果得到了210个DNA分子,D项错误。
10.有关PCR技术的说法,下列叙述不正确的是( )
A.多聚酶链式反应,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环,每次循环分为变性、复性和延伸
答案 C
解析 PCR是多聚酶链式反应的英文缩写,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,也需要提供模板(母链)、酶、原料、引物等条件。
PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可分为变性、复性和延伸三步。
11.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答下面的问题。
(1)A过程高温使DNA变性解旋,对该过程的原理叙述正确的是________。
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是耐高温的____________。
这种酶在高温下仍保持活性,因此在PCR扩增时可以________加入,________(填“需要”或“不需要”)再添加。
PCR反应除提供酶外,还需要满足的基本条件有:
______________________________________________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记,游离的脱氧核苷酸不做标记,控制“95℃-55℃-72℃”温度循环3次,则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占________。
答案
(1)C
(2)DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸,通过控制温度和酸碱度使DNA复制在体外反复进行 (3)25%
解析
(1)高温所起的作用类似于解旋酶,使双链DNA变为单链。
(2)C过程是PCR技术的延伸阶段,当系统温度上升到72℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
这种DNA聚合酶