氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备.docx

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氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备

氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备

【摘要】目的：

为了提高氟尿苷的疗效，降低其毒副作用而制备氟尿苷二乙酸酯固体脂质纳米粒.方法：

在吡啶和4二甲氨基吡啶存在时，FUDR与乙酸酐反应，制备氟尿苷二乙酸酯，并测定其核磁共振氢谱.RPHPLC测定其在正辛醇和磷酸盐缓冲液中的分配系数及不同pH缓冲液和组织匀浆中的稳定性.采用薄膜分散法制备FUDRASLN；透射电镜研究其形态、粒径及粒径分布；RPHPLC测定载药量、包封率.结果：

制备成的FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快；在血清和组织匀浆中易水解，在肝匀浆中水解最快；FUDRA分配系数为FUDRASLN粒径为nm，载药量为％，包封率为％.结论:

FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加；FUDRASLN包封率较高，粒径分布较均匀.

　　【关键词】氟尿苷；固体脂质纳米粒；靶向给药系统

　　0引言

　　氟尿苷（floxuridine,FUDR）是5氟尿嘧啶的脱氧核苷衍生物，是有效的抗代谢类抗消化道肿瘤新药，主要用于肝癌治疗.为了增加其肝靶向性，我们制备了氟尿苷固体脂质纳米粒，但FUDR的脂溶性较小，制备固体脂质纳米粒比较困难，故将FUDR酯化，合成了氟尿苷二乙酸酯（FUDRA），以大豆磷脂为药物载体，制备FUDRASLN，期望药物静注后可浓集于肝脏，达到提高疗效，降低毒副作用的目的.

　　1材料和方法

　　材料

　　RE52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV265型紫外可见分光光度计；INOVA400超导核磁共振仪；LC10Avp高效液相色谱仪；色谱柱：

KromasilC18柱，5μm，mm×mm；KQ250型超声波发生器（江苏昆山淀山湖检测仪器厂），BP190S电子天平（德国赛多利斯），XW80A漩涡混合器；JEM2000Ex型透射电子显微镜；TG16W微量高速离心机；SephadexG50葡聚糖凝胶.药品和试剂：

FUDR；乙酸酐；大豆磷脂.其他药品和试剂均为分析纯.昆明种小鼠5只，体质量（20±2）g,由第四军医大学实验动物中心提供.

　　方法

　　的合成及结构鉴定FUDR　g，加入干燥的二氯甲烷30mL中，依次加入乙酸酐g，吡啶3mL，催化量4二甲氨基吡啶.反应混合物室温搅拌3h，反应结束后加入250mL乙酸乙酯，依次用稀HCl，稀NaHCO3和H2O洗涤，加入适量无水Na2SO4干燥2h，过滤，滤液旋转蒸发，除去大部分乙酸乙酯，加入石油醚使产物结晶析出，抽滤，干燥.合成路线如图1所示.进行核磁共振氢谱（1HNMR）鉴定.

　　稳定性考察反相高效液相色谱法（RPHPLC）测定FUDRA的含量.流动相∶甲醇水（35∶75）；流速：

1mL/min；检测波长：

268nm；保留时间：

（±）min；温度：

25℃.配制FUDRA系列浓度标准液，分别进样20μL，以峰面积对浓度进行线性回归，在～mg/L范围内有良好的线性关系，回归方程为A=-+33317c，相关系数r=，（n=5）.高、中、低三种浓度的平均回收率为%（RSD=%）.精密吸取FUDRA（mg/L）甲醇液1mL，加到9mL37℃水浴预热的pH分别为,,,的缓冲液中,混漩振荡1min后,置入37℃水浴中,于不同时间点取样20μL进样，测定残留FUDRA浓度.以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求反应速率常数和FUDRA水解半衰期.为评价FUDRA在体内转化为FUDR的速度，进行了FUDRA在小鼠血清及不同组织匀浆中的水解动力学研究.小鼠眼眶取血后处死，迅速取出肝、肾、肺组织.血浆离心10min，取上清液mL加pH的缓冲液mL；肝、肾、肺组织称质量，加五倍量pH的缓冲液,匀浆，离心10min，取上清液mL，加pH的缓冲液mL，混匀.向37℃水浴中预热的血清及组织匀浆稀释液中加入FUDRA贮备液各mL，漩涡混合1min，于不同时间取样200μL，加甲醇500μL，混合1min，离心5min，取上清液20μL进样，测定残留药物浓度.以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求FUDRA水解速率常数和半衰期.

　　分配系数（P）的测定精密量取FUDRA的正辛醇溶液5mL，加入用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液5mL,混合5min,HPLC法测定两相FUDRA浓度；用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液配制FUDR溶液，精密量取该液5mL，加入正辛醇5mL,混合5min,RPHPLC法测定两相中FUDR浓度.P=C醇/C水,C醇表示在正辛醇中的浓度,C水表示在水中的浓度.

　　的制备在单因素考察的前提下，利用薄膜超声分散法通过均匀设计优化制备工艺.精密称取FUDRA10mg，大豆磷脂90mg于100mL圆底烧瓶中，加入15mL氯仿溶解.旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜.加入60g/L甘露醇水溶液mL，水浴超声两次，每次30min，分装于安瓿中.

　　的形态学研究取FUDRASLN胶体溶液适量，加适量水稀释，滴加在铜网上，用20g/L的磷钨酸钠液染色，用JEM2000Ex型透射电子显微镜观察并拍照，统计100个纳米粒的粒径.

　　的包封率和载药量的测定采用凝胶层析法.精密量取FUDRASLN胶体溶液mL上柱，洗脱液为蒸馏水，每mL收集一次，流速为mL/min，层析温度为室温.HPLC法测定固体脂质纳米粒中药物含量.另取mLFUDRASLN胶体溶液，置50mL的容量瓶中，甲醇溶解，定容.HPLC法测FUDRA浓度C0.包封率=×100%，载药量=×100%.

　　统计学处理：

考察时间与Ln（C/C0×100）之间的线性关系，用SPSS对数据进行相关分析，计算Pearson相关系数r，检验水准α=

　　2结果

　　得片状结晶g，产率91％，mp～℃.1HNMRδ=（s,1H,NH）；（d,1H,C6H）；（t,1H,C1′H）；（m,1H,C3′H）；（m,1H,C4′H）；（m,2H,C5′H）；（m,1H,C2′H）；（m,1H,C2′H）；（s,3H,CH3CO）；（s,3H,CH3CO）.

　　在不同pH缓冲液中的稳定性pH对FUDRA稳定性影响较大.FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快.由相关系数r可见，水解为表观一级反应.表1氟尿苷二乙酸酯在不同pH缓冲溶液中的一级水解常数（Kobs）和半衰期（略）

　　在小鼠血清和不同组织匀浆中的稳定性经HPLC检测,FUDRA在血清和组织匀浆中水解成FUDR.由相关系数r可见，水解为表观一级反应.血清和组织匀浆中的酶可显着地加速前体药物的水解，特别是在肝匀浆中.表2不同浓度组织匀浆和缓冲溶液中氟尿苷二乙酸酯的一级水解常数（Kobs）和半衰期（略）

　　的分配系数FUDRA和FUDR的分配系数分别为和，说明FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加.

　　的载药量、包封率和形态HPLC法测得FUDRASLN的载药量为%,包封率为%.FUDRASLN为略带淡蓝色的胶体溶液，透射电镜下可见许多圆形或椭圆形的球粒.纳米粒的粒径nm.

　　3讨论

　　SLN是近年正在发展的一种新型纳米粒类给药系统.它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、甘油三酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中，制成固体胶粒给药系统［1］.SLN的制备方法主要有高压乳匀法、乳化分散法、溶剂乳化法、薄膜超声分散法等.高压乳匀法、乳化分散法等需要加热到一定的温度，对FUDRA的稳定性有影响.薄膜超声分散法简便易行，适合于实验室制备.

　　SLN主要适合于包封亲脂性药物［2］.将含有羟基的水溶性药物酯化制成亲脂性前体药物，可以提高其包封率［3］.FUDR的亲水性较强，与乙酸酐反应转化为FUDRA后，脂溶性明显提高，此反应操作简便，产物易分离纯化.大豆磷脂毒性低于合成材料，体内可降解且有良好生理相容性［4］，故选其作为药物载体.在选择SLN分散介质时，曾使用磷酸盐缓冲液和蒸馏水.用磷酸盐缓冲液作分散介质的SLN在1d内即很快混浊、分层，表明药物大量泄露，磷脂凝聚.这是因为电解质的加入减小了体系中各种粒子间的静电排斥作用，促进了脂质载体晶型的转变［5］.蒸馏水的渗透压太小，用蒸馏水作分散介质的SLN在3wk后也混浊、分层.实验证明60g/L甘露醇水溶液作分散介质的SLN室温放置3mo也无混浊现象.

　　FUDRA在不同pH缓冲液中的稳定性研究表明，pH对FUDRA稳定性影响较大，pH时t1/2为h，而pH时t1/2为h.由相关系数r可见，水解为表观一级反应.FUDRA在血清和组织匀浆中的降解动力学研究表明，FUDRA在体内很快被脏器中的酯酶水解为FUDR，由此推测FUDRASLN被细胞吞噬后，会迅速水解为FUDR而发挥治疗作用.

　　文献［6］报道小于7μm的微粒静注后，由于单核巨嗜细胞系统的吞噬作用大部分被摄入肝脾.本实验我们所制成的FUDRASLN粒径在此范围内，理论上推测具有肝靶向性.小鼠体内的分布研究正在进行.我们以前进行过十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的研究［3，7］，结果表明LAPSLN具有较高的载药量和包封率，肝靶向性良好，据此从实践角度推测FUDRASLN具有肝靶向性.

　　【参考文献】

　　［1］连佳芳，张三奇.固体脂质纳米粒研究进展［J］.第四军医大学学报,2005,26（17）:

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　　［2］于波涛，张志荣，曾仁杰.肝靶向氟尿嘧啶类脂纳米粒的研究［J］.药学学报,2000,35（9）:

700-705.

　　［3］薛克昌，顾宜，张三奇，等.十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的制备［J］.第四军医大学学报，2003,24:

890-892.

　　［4］MullerRH,MaassenS,SchwarzC.Solidlipidnanoparticles（SLN）aspotentialcarrierforhumanuse:

Interactionwithhumangranulocytes［J］.JControlRelease,1997,47（3）:

261-265.

　　［5］王建新,张志荣.固体脂质纳米粒的研究进展［J］.中国药学杂志，2001，36

（2）:

73-76.

　　［6］YudaT,MaruyamaK,IwatsuruM.Prolongationofliposomecirculationtimebyvariousderivativesofpolyethyleneglycols［J］.BiolPharmBull,1996,19（10）:

1347-1351.

　　［7］薛克昌，张三奇，顾宜，等.十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的肝靶向研究［J］.解放军药学学报，2004,20：

1-4.