口蹄疫疫苗研究进展.docx

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口蹄疫疫苗研究进展

口蹄疫疫苗研究进展

口蹄疫疫苗的研究进展【综述】【摘要】口蹄疫是被列为A类疫病的家畜传染病之一，接种疫苗是防止该病流行的有效措施。

本文就口蹄疫灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、转基因植物可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因工程弱毒疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗及空病毒衣壳蛋白疫苗的最新研究进展作一综述。

【关键词】I=1蹄疫；疫苗ProgressinResearchonFoot--and．-MouthDiseaseVaccineCHENLi—xin，JINYu—zhu，HURong—liang（Departmentof印idemiology，InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine，AcademyofMilitaryMedicine，Changchun130062，China）【Abstract】Foot．and．mouthdiseaseisoneoftheinfectiousdiseaseclassAinanimals．Vaccinationisaneffectivemeasureforpreventionofepidemicofthedisease．Thispaperreviewedthedevelopmentinresearchoninactivatedvaccine，recombinantsubunitvaccine，edibletransgenicplantvaccine，syntheticpeptidevaccine，proteinvector-basedvaccine，recombinantattenuatedvaccine，livevector-basedvaccine，DNAvaccineandemptycapsidproteinvaccineagainstfoot—and-mouthdisease．【Keywords】Foot—and—mouthdisease；Vaccine口蹄疫（Foot．and—mouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot．and．mouthdiseasevirus，FMDV）引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪等，发病率极高，传播速度极快。

世界动物卫生组织将其列为A类人兽共患病首位。

虽然该病的死亡率不高（幼畜除外），但可造成动物生产性能下降，且扑杀动物需花费大量的人力、物力和财力，还会影响国际贸易，造成严重的经济损失?

。

疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。

FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV新型疫苗，如亚单位疫苗、转基因植物可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因工程弱毒疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、空病毒衣壳蛋白疫苗等不断问世。

本文就FMD疫苗的研究进展作一综述。

1．灭活疫苗常规灭活疫苗是田间毒株经病毒培养扩增，灭活剂处理后添加佐剂制成的。

灭活疫苗因其安全可靠及有一定的免疫力，已广泛应用于预防和消灭口蹄疫。

Frenkel用培养的牛舌皮组织建立的大规模作者单位：

1军事医学科学院军事兽医研究所流行病学研究室（长春130062）；2吉林大学畜牧兽医学院（长春13o062）．通讯作者：

扈荣良，E—mail：

hur0niang@hotmail．coln病毒抗原生产技术获得成功。

20世纪60—70年代末，随着细胞培养技术的发展，在口蹄疫疫苗制备等方面取得了巨大成功。

目前，用胺类衍生物作为FMDV的灭活剂，在小动物实验中已取得理想的效果f3_3。

杨永钦等[将BHK21细胞培养的FMDV亚洲I型（Asia．1）用胺类衍生物灭活，经细胞连续传代，未产生细胞病变（CPE），接种动物后，产生了良好的免疫原性，并能有效地保护豚鼠抵抗强毒攻击，保护率达100％。

将0型、Asia．1型口蹄疫病毒灭活后，按一定比例配制O型、Asia一1型FMD灭活二联苗，免疫豚鼠，制备的阳性血清经常量细胞中和试验，能完全抑制细胞病变的发生，且免疫豚鼠能有效地抵抗O型、Asia一1型FMDV的单独感染及混合感染。

2．基因工程亚单位疫苗FMDV基因工程亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达的VP1蛋白，制备疫苗。

1981年，Kupper等[5克隆了FMDVVP1基因，将其插入原核表达载体PL启动子的下游，实现了VP1基因的原核表达，并通过间接ELISA和放射免疫试验证实其表达产物具有抗原性，为FMDV基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论依据。

同年，Kield等[]用大肠杆菌表达的A型FMDVVP1蛋白免疫猪和牛，均可诱导中和抗体的产生，用高浓度的VP1蛋白免疫牛或重复进行接种，可使牛抵抗FMDV强毒的攻击。

金华利·302·中国生物制品学杂志2009年3月第22卷第3期ChinJBiologicalsMamh2009，Vo1．22No．3等]在毕赤酵母中成功表达了FMDVVP1蛋白，动物实验表明，FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液及细胞免疫应答，为研制新型FMDV基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

3．转基因植物可饲疫苗转基因植物可饲疫苗是利用转基因技术将抗原基因导人植株中，获得表达抗原蛋白的植株。

FMD转基因植物可饲疫苗是研究较早、效果较好的例子之一。

1999年，Wigdorovitz等l8]将FMDVVP1基因在苜蓿中有效表达，表达产物经口服和注射，均产生了免疫反应和保护力，对利用转基因植物生产疫苗提供了有力的支持。

近来，研究者逐渐将目光转移到FMDV强毒结构蛋白P1基因，以其用于基因工程疫苗的研究。

P1基因在3c蛋白酶的作用下裂解，组装成的空衣壳保留了感染性病毒粒子的免疫原性和抗原性，以其作为亚单位疫苗的免疫原基因是一种很好的选择。

2005年，DusSantos等将FMDVPI基因和编码蛋白酶的3c基因作为免疫原基因导入紫花苜蓿，免疫小鼠后产生了特异性抗体，并能抵抗强毒的攻击。

国内关于FMD转基因植物疫苗的研究起步较晚，但已取得了较大进展。

潘丽等[0将0型FMDVP12X．3C基因成功导入番茄和拟南芥中，该基_______因在植物种子中能够特异性表达，将番茄叶浸出物免疫豚鼠，可产生特异性抗体反应，并能抵抗强毒的攻击。

Jiang等1]以1株突变的烟草花叶病毒作为载体，成功地表达了0型FMDVVP1基因上具有特征性的抗原表位肽F11（P142～A152）。

另外，用此载体将VP1基因上的两个抗原表位F14（R200～L213）和F11进行融合表达，也获得了成功[1。

FMDV转基因植物疫苗如果要投入使用，还需要对分子生物学相关方面及FMDV的免疫机理，尤其是对黏膜免疫的分子机制进行深入研究。

4．合成肽疫苗合成肽疫苗是根据免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原决定基小肽制备的疫苗。

Parry等㈨用化学法合成了FMDVVP1基因编码的140～160及200～213位肽段的基因片段，并在大肠杆菌中获得了表达，用其免疫牛、猪等均获得了较好的免疫力。

Doel等¨分别用A、0、C血清型FMDVVP1基因的141—158和200～213位肽段组成的40个aa合成肽免疫牛和豚鼠，结果均产生了特异性高水平的中和抗体，0、A型肽免疫豚鼠可抗相应病毒的攻击，并获得完全保护。

Wang等根据透明质酸酶位点、FMDVVP1蛋白2l～40和134～169位氨基酸序列用化学方法合成的肽段，可以使豚鼠产生高水平的中和抗体，且大部分豚鼠能够抵抗台湾O1型FMDV的攻击。

2008年，Greenwood等_】]以O1K型FMDVVP1蛋白上的126～150、141～165、189—213位氨基酸序列分别合成肽段，加入惰性纳米珠作为抗原，刺激绵羊体内树突状细胞对合成肽的免疫反应，结果显示，纳米珠与肽段的混合物可以产生有效的细胞免疫和体液免疫反应。

5．蛋白质载体疫苗蛋白质载体疫苗是将FMDVB细胞或T细胞抗原表位与大的蛋白质分子基因或形成类病毒粒_J的结构基因融合制备的疫苗，该类疫苗利用载体基因蛋白或类病毒粒子的抗原提呈作用，刺激T细胞，增强机体细胞免疫反应。

Bittle等l1根据FMDV0型VP1蛋白氨基酸序列，合成了140～160位氨基酸肽段，与载体蛋白偶联后免疫豚鼠，能诱导豚鼠的中和抗体。

赵凯等lI8以自体免疫球蛋白作为外源抗原的载体制备疫苗，经动物实验证明其有良好的保护效果。

Chan等[1将FMDVVP1基因的141～160和200～213位氨基酸序列串联，与猪IgG的重链基因末端融合，以其表达产物免疫猪，可以抵抗50LD卯的FMDV的攻击。

蛋白质载体疫苗是近年来的研究热点之一，其安全性高，免疫原性好，有广阔的应用前景。

6．基因工程弱毒疫苗传统的弱毒疫苗是将强毒毒株反复在非易感动物（如小鼠、兔和鸡胚）身上传代，直至病毒的毒力减弱。

虽然应用弱毒FMD疫苗能使免疫动物产生一定程度的保护力，但也发现对某种动物不易感的弱毒疫苗，对其他种的偶蹄动物易感。

另外，要获得毒力弱而免疫原性良好的弱毒毒株非常困难，即使获得了理想的弱毒毒株，也存在毒力返强的危险。

近年，已研究出利用基因工程技术突变病毒基因组或删除病毒某一蛋白编码区来制备弱毒疫苗的方法。

据报道，利用DNA重组技术删除VP1基因上的RGD受体结合位点，所获得的重组病毒对小鼠和猪不致病，免疫牛则可以产生高水平的中和抗体，并对病毒攻击能产生完全的保护效果。

应用这种疫苗的最大问题是FMDV可能在选择压力下产生能利用机体其他受体进入宿主细胞的变异株]。

此外，有研究报道，删除编码L区的序列获得的重组病毒可以在BHK细胞内复制，但对猪和牛不致病，且能诱导高水平的FMDV中和抗体。

攻毒试验表明，部中国生物制品学杂志2009年3月第22卷第3期ChinJBiologiealsMarch2009，Vo1．22No．3·303·分免疫动物可获得保护，未获得保护的动物也大大推迟了发病及出现典型症状的时间[。

7．活载体疫苗活载体疫苗是将微生物保护性抗原基因插入载体病毒，如痘病毒、疱疹病毒等的特定位置上，转染细胞，在细胞中复制的同时表达外源基因。

一个载体病毒中可同时插入多个外源基因，表达多种病原微生物的抗原，同时起到预防多种传染病的作用。

目前，用于表达口蹄疫病毒抗原的病毒载体主要有痘苗病毒、腺病毒、核心多角体病毒、脊髓灰质炎病毒、牛鼻气管炎病毒、牛瘟病毒及烟草花叶病毒等[。

李志勇等成功构建了含有0型FMDVP1基因及弱毒非结构蛋白3CD基因的重组腺病毒，为进一步研制FMD活载体疫苗提供了依据。

2008年Du等将FMDVP1基因和猪的干扰素基因同时插入人腺病毒基因中，构建重组腺病毒，免疫豚鼠后，可产生高水平的中和抗体，并可保护豚鼠免受O型FMDV的攻击。

2006年，Liu等[]将O型FMDVP1基因插入犬2型腺病毒基因的E3区，免疫猪后产生了一定水平的中和抗体。

2xxx年，Berinstein等[26]用带有FMDVVPI区基因的重组痘病毒免疫小鼠，可保护小鼠免受同源病毒的攻击。

2008年，金明兰等[凹]将FMDV衣壳蛋白前体P1．2A基因和蛋白酶3C基因插入鸡痘病毒表达载体中，构建重组鸡痘病毒，免疫小鼠后，可产生较高水平的特异性抗体和中和抗体。

Ma等]将FMDV的衣壳蛋白P12A基因、3C编码区基因、猪白细胞介素18基因等重组进鸡痘病毒基因组中，免疫动物后，可产生对0型FMDV的部分保护作用。

活载体疫苗具有广阔的发展前景，通过共同表达一些T细胞位点和细胞因子，可使活载体疫苗的免疫效果进一步提高。

8．核酸疫苗由于FMDV血清型多，各型之间无交叉保护性，给FMD的防治带来巨大的困难。

随着基因免疫概念的问世及其技术的完善，为FMDV免疫带来契机。

Benvenisti等]将FMDV完整的结构基因Pl和非结构基因2A、3CD串联起来，同时加入脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点，通过免疫荧光和免疫斑点技术检测到病毒蛋白在体外表达和加工，利用基因枪注射到猪皮肤中，部分猪可抵抗FMDV强毒的攻击。

Shieh等]为了克服亚单位疫苗不能产生持久免疫保护的缺点，通过基因免疫和亚单位疫苗联合免疫来增强其免疫效果。

首先用含有FMDV主要免疫原性基因VP1的质粒免疫鼠，接下来用VP1多肽偶合物（P29一KLH）刺激，免疫鼠产生了高效价的抗体，并具有中和FMDV的活性。

常巧呈等[，1]构建了共表达复合多位基因表达盒DAAT及Asial型FMDVP1．2A．3C基因的重组DNA疫苗，免疫小鼠后，产生了特异的细胞免疫和体液免疫应答。

9．空病毒衣壳蛋白疫苗空病毒衣壳蛋白疫苗是含有全病毒所有的蛋白抗原位点，而缺少病毒核酸的一种新型疫苗。

由于缺少核酸的病毒衣壳蛋白疫苗不能产生病毒的非结构蛋白，因此应用这种疫苗免疫动物，可以利用现有的诊断病毒非结构蛋白的血清学方法，简便地区分出免疫动物和感染动物。

在大肠杆菌和杆状病毒表达系统所获得的FMDV衣壳虽然能提供一定的保护，但还不能达到灭活病毒所产生的保护效果，其主要原因是全病毒FMDV衣壳的表达量不高。

为了提高表达量和投放空衣壳蛋白的效率，也有利用腺病毒的报道[32]，其攻毒试验证明具有一定的保护效果。

lO．小结理想的疫苗必须安全、有效，同时还应具备价廉、易于推广等优点。

虽然FMDV灭活疫苗具有良好的免疫原性，但潜在的不安全性影响了其应用；另外，由于灭活疫苗制备的成本高，价格昂贵，限制了该疫苗的推广。

新型FMDV疫苗具有安全性高、可根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗、大幅度降低生产成本等优点，因此是未来发展的方向。