黄酮类化合物的提取与分离方法综述.docx
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黄酮类化合物的提取与分离方法综述
黄酮类化合物的提取和分离方法的综述
摘要
黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物,具有比较强的生物活性和生理作用,按结构可分为黄酮类和黄酮醇类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类、查尔酮类、双黄酮类、异黄酮类以及其它黄酮类等。
目前,黄酮类化合物的提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取分离法、半仿生提取法等,各种提取方法都有它的优缺点。
本文对上述几种提取方法近年来的应用及研究进展做了简单综述,旨在为黄酮类化合物的研究、开发、应用提借鉴
关键词：
黄酮类化合物；性质；提取；分离；前景
黄酮类化合物又称黄碱素,广泛存在于自然界的植物中,属植物次生代谢产物,是一类具有种生物活性的多酷类化合物,其在植物体内大部分与糖结合成苷类,小部分以苷元的形式存在[1]。
许多研究己表明黄酮类化合物安全、无毒,具有抗菌、消炎、清热解毒、镇静、利尿等作用外,它是大多数氧自由基的清除剂,对冠心病、心绞痛等疾病的治疗效果显著。
特别是由基和抗癌、防癌的作用,使黄酮类化合物的研究进入了一个新的阶段。
随着食品工业的发展与消费观念的改变,天然活性成分的保健食品成为现代人追逐的目标,其中黄酮类化合物以纯天
然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人们的关注。
1.黄酮类化合物的概述
黄酮类化合物（flavonoids）指的是两个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。
根据中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置（2-或3-位）以及三碳链是否构成环状等特点,可将重要的天然黄酮类化合物分为黄酮类（flavone）、黄酮醇类（flavonol）、二氢黄酮类（dihy-droflavone）、二氢黄酮醇类（dihydroflavonol）、异黄酮类（isoflavone）等15种。
大部分学者认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的,经同位素标记实验证明了A环来自于三个丙二酰辅酶A,而B环则来自于桂皮酰辅酶A。
三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A在查尔酮合成酶的作用下生成查尔酮,再经过查尔酮异构化酶的作用形成二氢黄酮。
其他黄酮类化合物大多是经过二氢酮在各种酶的作用下生物合成而得到。
现已发现的黄酮类化合物中,以黄酮醇类最为常见,约占总数的三分之一,其次为黄酮类,占总数的四分之一以上,其余则较少见。
黄酮类化合物广泛分布于植物界中,多与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在,也有以游离形式存在的。
天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基烃氧基、异戊烯氧基等取代基,由于这些助色团的存在,使该类化合物多显黄色。
黄酮类化合物具有心血管系统维护、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛、保肝等多种生物活性,并且大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、雌性激素样、泻下、解痉等生物活性。
因此黄酮类化合物的研究深受国内外学者的重视。
黄酮类化合物的分子特点是:
相对分子质量较低,从几百到几千;具有一定的极性,可溶于许多有机溶剂中。
活性成分的提取与精制是中药现代化的重要组成部分,除传统的有机溶剂提取之外,现代科技的发展也提供了超临界流体萃取、双水相萃取等技术。
本文以黄酮类化合物现阶段的提取、精制方法,以及各种方法的优缺、发展现状作一综述。
2.黄酮类化合物的性质
黄酮类化合物具有以下性质
2.1黄酮类化合物多为晶形固体,少数化合物（如黄酮普类）为无定形粉末,有较高的熔点,分子结构中,大多带有酚性轻基,因此具有酚类化合物的通性。
另外,分子中还常带有毗酮环或碳基,构成了生色团的基本结构,根据轻基的数目,结合的位置与交又共扼体系,构成了黄酮类化合物的呈色。
一般来说,黄酮及黄酮醇和其昔类多呈灰黄到黄色。
2.2黄酮类化合物的溶解度,因结构及存在状态（普或营元,单糖普,双糖苷或三糖普）不同而有很大差异。
一般游离普元难溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酷等有机溶剂及稀碱液中;而黄酮营一般易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂,难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂。
2.3黄酮类化合物大多具有强的荧光,在紫外灯照射下呈现亮黄、黄绿、亮蓝、暗棕等颜色。
2.4黄酮类化合物对盐酸镁粉或汞齐呈鲜红、紫色或黄色反应。
结构中带有3一oH,5一OH或邻位轻基者,均能与金属盐类试剂,如铝盐、镁盐、镁盐和铁盐等形成颜色较深的络合物。
天然黄酮类化合物多以着类形式存在,并且,由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同,可以组成各种各样的黄酮
3.黄酮类化合物的提取
3.1热水提取法
热水提取法热水一般仅限于提取苷类,所以对黄酮苷类物质含量较高的原料,可以采取热水提取法。
在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素。
此工艺成本低、对环境及人类无毒害,可应用于工业化大规模生产。
郭京波等[2]以水做溶剂,同时提高浸提温度、延长浸提时间和增加液料比,可以明显提高丁的产率。
金春雪等[3]在银杏叶中提取黄酮类化合物,先将银杏叶瞭干,用水浸泡一天、沸水煮半小时,文火焖蒸半小时,静置取上层黄绿液,蒸发、萃取、过滤即得。
李冬菊等[4]用热水提取法从山梧叶中提取总黄酮,采用的是全物理过程无污染,但是具有提取杂质多,收率较低,提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时等缺点。
3.2微波辅助提取法
微波是一种非电离的电磁辖射。
微波提取法是利用不同结构的物质在微波场中吸收能力的差异,使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热,从而使被提取物质分离开来,微波辅助提取法具有选择性高、操作时间短、消耗溶剂量少、提取效率高、污染小等特点,可用于对热不稳定的物质的提取。
张玉香等采用微波辅助提取法提取蓝萄叶中的总黄酮,结果表明提取率为4.2%。
张国铭等[5]采用微波辅助提取法提取山竹夹层中黄酮类化合物,提取溶剂为90%甲醇,微波时间为15s,提取一次时提取率就可达8.8%。
提取量是溶剂提取法的1.65倍,所用时间是后者的1/80;叶春等釆用微波辅助提取法提取鱼腥草叶中总黄酮,结果显示提取率可达95%以上,与传统乙醇提取法相比,微波辅助提取节省时间,提取率高。
刘峙噪等[6]采用微波辅助提取法提取银杏叶中黄酮类物质,微波时间5min后,进行抽提L5h,效果显著利用微波提取所用时间短,提取率是传统提取的2.2倍。
Weihuaxiao等[7]用微波辅助提取法快速提取紫云英根中的黄酮类物质,考察了微波功率、提取周期、乙醇浓度、提取温度、放射时间和固液比等因素对提取率的影响,结果表明当使用90%的乙醇,25mg/g的样品在ll（rC萃取25min,黄酮类物质的产率最大
3.3双水相提取法
双水相体系是由两种水溶性高分子化合物或一种高分子化合物与一种盐类在水中所形成的互不相溶的两相体系,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离。
与传统的萃取方法相比,双水相提取法所形成的两相大部分为水,两相界面张力很小,为有效成分的溶解和萃取提供了适宜的环境,相际间的质量传递快、操作方便、时间短、条件温和、易于工程放大和连续操作。
张春秀等将银杏叶浸提液加入双水相体系中,将黄酮类化合物分离,提取率可达98.2%。
3.4超临界提取
超临界流体萃取法是近十年来才发展起来的一种新型技术,它利用超临界流体作为萃取剂从液体和固体中提取某种高沸点的成分,以达到分离或提纯的目的瞬】。
超临界流体是处于临界温度和压力以上的流体。
在这种条件下,流体即使处于临界温度下,也不会浓缩为液体,但流体的密度随压力而增加,此时超临界流体相既不同于一般的液相,也有别于一般的气相。
其密度接近于液体,粘度却接近于普通气体,扩散能力又比液体大100倍。
与一般液体溶剂相比,在超临界流体中可更快地进行传质,在短时间内达到平衡,从而高效地进行分离。
尤其是对固体物质中的某些成分进行提取时,由于溶剂的扩散系数大,粘度小,渗透性能好,因此可以简化固体粉碎的预处理。
超临界流体的密度接近于普通液体的密度,因此,超临界流体对液体、固体的溶解度也与液体相接近。
由于超临界流体的溶解能力与密度有很大关系,因此温度和压力的变化会大大地改变其溶解能力。
黄酮类化合物的分离用于超临界萃体的流体,必须具备下列条件:
（l）化学性质稳定,对设备没有腐蚀性:
（2）临界温度接近室温或操作温度,不要太高或太低;
（3）操作温度应低于萃取组分的分解、变质温度;
（4）临界压力应该低（降低压缩动力）;
（5）选择性高（易得到高纯制品）;
（6）对萃取物质的溶解度高（可减少溶剂循环量）;
（7）货源充沛,价格低廉;
（8）在医药食品工业使用时,必须对人体无毒害。
在工艺过程中,除要求超临界流体具有良好的溶解性能外,还要求有良好的选择性，以有效地去除杂质,提高溶剂选择性的基本原则是:
（l）操作温度与超临界流体的临界温度相近;
（2）超临界流体的化学性质与被萃取物质的化学性质相近,因此可以选取与被萃取溶质相近的气体作为萃取气体,进行选择性萃取。
到目前为止,作为超临界流体应用的萃取剂主要有:
乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、苯、氨、二氧化碳等,其中二氧化碳具有无毒、不易燃、不易爆、不腐蚀、价廉易得、临界温度接近常温、临界压力低、溶解能力好等优点,受到普遍的重视,是最常用的超临界萃取剂。
与一些传统的分离方法相比,超临界流体萃取具有许多独特的优点:
（l）超临界流体的萃取能力取决于流体密度,因而很容易通过调节温度和压力来加以控制。
由于超临界流体兼有液体和气体的特性,其萃取效率一般高于液体溶剂萃取;
（2）溶剂回收简单方便,节省能源。
通过等温降压或等压升温被萃取物就可以与萃取剂分离;
（3）由于超临界萃取工艺可在较低温度下操作,故特别适合天然物质的分离,以保持其生物活性;
（4）可较快地达到平衡,过程无相变。
采用该法制得银杏叶黄酮类化合物的黄绿色精提物,得率为4.1%,其中黄酮含量在35%以上。
随着超临界流体的迅速发展,用该技术提取天然植物中的药用有效成分也越来越广泛。
与传统的提取工艺比较,超临界流体具有提取效率高,无溶剂残留毒性,天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏而保持其天然特性等优点,同时,还可以通过控制临界温度和压力的变化,来达到选择性提取和分离纯化的目的。
但是超临界流体需要在较高的压力下操作,因此设备费用比较昂贵,而且需高压技术,在设备和过程设计上还缺乏基础数据和系统的方法,在我国的应用未普及[8-9]
4.黄酮类化合物的分离
由于黄酮化合物的性质不同,其分离原理有:
（1）极性大小不同,利用吸附能力或分配原理进行分离;
（2）酸性强弱不同,利用pH梯度萃取进行分离;（3）分子大小不同,利用葡聚糖凝胶分子筛进行分离;（4）分子中某些特殊结构,利用与金属盐络合能力的不同进行分离.
4.1pH梯度萃取
pH梯度萃取适合分离酸性强弱不同的游离黄酮类化合物.将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）,依次用5%碳酸氢钠（萃取7,4′-二羟基黄酮）、5%的碳酸钠（萃取7-羟基黄酮或4′-羟基黄酮）、0.2%氢氧化钠（萃取一般酚羟基黄酮）、4%氢氧化钠（萃取5-羟基黄酮）萃取而使其分离[3].2.2 高效液相色谱分析（HPLC）法运用HPLC法分离黄酮类化合物的报道很多.有人对18种黄酮及黄酮苷类化合物在C8、C18和CN3种固定相上洗脱的RP-HPLC法分离做了研究,结果表明C18基本可以使植物黄酮苷元和配基实现分离,但它对极性大的苷部分洗脱出峰快,分离效果不大理想.而C8介于C18和CN之间,因而对黄酮苷的分离比较理想,峰形和分离也最好[11].HPLC也可以用来测定黄酮的含量[12].
4.2高速逆流色谱分离法
高速逆流色谱分离法（highspeedcountercur-rentchromatography,HSCCC）是一种新的分离技术.其具有两大突出特点:
（1）线圈中固定相不需要载体,因而清除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象;
（2）特别运用于制备性分离,每次进样体积较大,进样量也较多.李彩侠等[13]提取荷叶中黄酮类化合物,经HSCCC分离纯化的效果很好,结合TLC分析、颜色反应鉴定得到两种纯度很高的黄酮醇类化合物.HSCCC对分离和制备黄酮类化合物有很大的优势,其应用前景越来越受到人们的关注.
4.3柱色谱
4.3.1娃胶色谱法
硅胶层析法是根据物质在硅胶上吸附能力的不同而得到分离,由于娃胶中有微孔,所以不同化合物的吸附能力不同,选用适当的洗脱剂进行洗脱从而达到分离。
桂胶主要适用于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙醜化）的黄酮及黄酮醇类。
有时加水活化后也可用于分离极性较大的化合物,如多经基黄酮醇及其苦类等。
分离黄酮苷元时,可用氯仿-甲醇混合溶剂作流动相;分离黄酮苷时,可用氯仿-甲醇-水或乙酸乙酷-丙酮-水作流动相AhmetCakir等[14]用娃胶柱色谱从HypericumhyssopifoliumL.的地上部分提取物活性跟踪的活性部位分离得到了5个黄酮化合物:
双序菜素、槲皮素、槲皮素3-O-a-L-阿拉伯糖苷、槲皮素3-0-P-D-半乳糖苷、槲皮動-0-P-D-半乳糖苷-7-0-P-D-葡萄糖苷。
姜红芳等^1从毫菊花纯提物中取正丁醇萃取物30g,拌以等量桂胶,装入600g（160-200目）桂胶柱内,以石油醚-乙酸乙酯（3:
1、1:
1、1:
4）梯度洗脱,得到三个黄酮类化合物。
4.3.2聚酷胺柱色谱法
聚酸胺是一类纤维树脂,分子链上的重复结构单元是醜胺基的聚合物。
分离原理是因为其中含有酷胺基,黄酮类物质中含有酌经基,两者之间可形成氢键,其吸附强度主要取决于经基的数目与位置,以及形成氢键缔合能力的大小。
聚酰胺柱层析法分离效果好,样品容量大,适于在制备分离工艺中应用。
但洗脱速度慢,死吸附较大（损失有时高达30%）,常有低分子量酰胺的低聚物杂质混入,装柱时用5%甲醇或10%盐酸预洗除去低聚物。
杨武英等进行了聚酰胺树脂精制青钱柳黄酮的研究,结果发现,青钱柳黄酮粗提物经过聚酰胺树脂的三次吸附和解吸后,黄酮含量由粗品的11.40%升高到81.34%,纯度提高了6,14倍。
甘春丽等采用聚醜胺柱色谱分离手段成功分离了杨梅素和二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素。
4.3.3葡聚糖凝胶柱色谱法
葡聚糖凝胶在分离游离黄酮时,主要靠吸附作用,吸附程度取决于游离酷轻基的数目,游离盼轻基的数目越多越难以洗脱;在分离黄酮苷时,则分子蹄的属性起主导作用,相对分子质量的大小或含糖的多少决定化合物被洗脱的先后,分子量越大,连接的糖越多,越易洗脱。
葡聚糖凝胶在溶剂中膨胀成球形颗粒,具有三维空间的网状结构;由于凝胶网孔半径的限制,小分子物质能进入其内部,故通过色谱柱阻力增大,洗脱下来的速度慢,而大分子物质却被排除在外部,洗脱下来的速度快,当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量蹄分开了Andersen等人[15]先用AmberliteXAD-7和SephadexLH-20对草莓花色苷的粗提物层析分离后,再用HPLC进行鉴定,效果显著。
王岩等[16]在分离显齿蛇葡萄的化学成分研究中,洗脱液最后经SephadexLH-20柱层析纯化,分离得到二氧槲皮素。
4.3.4高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱是已经广泛应用于天然化合物的分离纯化手段,其柱效高、分离迅速是分离纯化不可缺少的方法。
正相固定相的HPLC主要用于分离无经基、甲基化或乙酷化的黄酮;反相固定相（如C18）的应用最为普遍。
采用甲醇-水-乙酸（或磷酸缓冲液）或乙腈-水作流动相,既可用于黄酮苦元的分离,又适应于黄酮苷的分离。
如果分离条件选择的适当,可一次性分离多种单体物质。
李军[17]等用制备型高效液相色谱对曲克丁原料进行分离纯化制得曲克声丁对照品。
田娜等[18]研究荷叶中黄酮类物质,利用HPLC法,以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,分离三种纯度较高的黄酮类物质。
经鉴定,该三种物质分别为金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷。
5.黄酮类化合物的应用
黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一,具有消除氧自由基、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、雌激素样作用、泻下、保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广谱的生理活性,且毒性较低,因此还可用作食品、化妆品的天然添加剂,如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等。
5.1 抗肝脏毒药物
水飞蓟是菊科水飞蓟属植物。
紫花水飞蓟种子的总黄酮提取物,内含水飞蓟素（Silybin）、异水飞蓟素（silydianin）、次水飞蓟素（silychvistin）,是常用抗肝炎药“益肝宁”、“利肝隆”及国外产品“silimarit”的主要有效成分,具有刺激新的肝细胞形成,抗脂质过氧化作用,用于治疗肝炎、肝硬化,并能支持肝的自愈能力,改善健康状况。
（+）-儿茶素近来在欧州也用作抗肝脏毒药物。
5.2天然抗氧化剂
黄酮类化合物作为合成抗氧剂如BHT、BHA等的代用品具有高效、低毒、价廉、易得的优点,日益受到重视。
中草药和茶叶是获取黄酮类抗氧剂的潜在资源。
茶多酚中主成分为儿茶素类衍生物,约占其总量的60%～80%。
其抗氧化能力优于BHT或dl-a-生育酚[19],是BHA的2.4倍[20]。
作者以槲皮素、异鼠李素为主的沙棘黄酮、银杏黄酮对沙棘油的抗氧化研究结果表明,其抗氧化效果与BHT相当,可能与多种抗氧化成分增效协调作用相关,大量研究表明,茶多酚可以有效地抑制油脂的过氧化物形成和多烯脂肪酸的分解,从而延长了油脂的货架期。
茶多酚已在保健食品,保健鱼油、食用油中得到广泛应用。
5.3天然甜味剂
黄酮类化合物作为非糖类甜味剂并非多见,但扩大了甜味剂新资源,目前发现主要为二氢查尔酮含氧甙。
芸香科柑桔类的幼果及果皮中,含有二氢黄酮类化合物,其本身无甜味,但在适当条件下转化成二氢查尔酮糖甙,则可显甜味。
如新橙皮甙二氢查尔酮,其甜度为蔗糖的950倍,从构效关系可知,7位新橙皮糖基是二氢查尔酮甜度必须的,如失去或换成芸香糖则无甜味;4′位引入烷氧基如乙氧基或丙氧基可分别增加甜度约10或20倍。
壳斗科多穗柯（Lithocarpuspolystachyus）和多穗稠（L.litseifolius）嫩叶、叶中二氢查尔酮葡萄糖甙以及胡桃科黄杞（Engelhardtiaroxburghiana）叶中二氢黄酮醇鼠李糖甙都有一定甜味。
寻找完全无毒、低热量、口味好的天然保健性甜味剂是当前植物资源利用的方向之一。
6.前景
近几年来,科学家对黄酮进行了广泛而深入的研究,发现了黄酮不少令人感兴趣的新用途,黄酮类天然产物是近年来天然药物和人类健康产品研究开发的热点.从药用植物和经济植物中提取具有生理活性的黄酮作为天然药物、保健品和化妆品等行业的原料,已日益引起重视,其应用前景无限广阔.随着科学技术的不断进步和发展,黄酮类化合物的独特效能将得到不断的发掘及应用.因此,黄酮类化合物的提取和分离方法也将得到更加深层的研究和开发,已有的方法将会日趋成熟和完善,各种高效、方便快捷的新方法将会不断涌现$
7.结语
黄酮类化合物不但分布范围广，种类多，而且生物活性广泛，并且毒性小，因此人们对他的研究越来越感兴趣，使得其分离提纯技术得以快速发展。
近年来虽然分离、提取了大量的新的黄酮类化合物，掀起了黄酮类化合物的研究热潮，但对其吸收、代谢机制、活性机理，具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识，因此应加强此方面的工作，弄清其生理功能从而进行有效地分离和提取，为黄酮类化合物在医药、食品工作中的应用提供理论依据，加速植物资源的有效开发利用，生产出具有治疗和预防多种疾病的药品和天然保健品。
每种方法都有它各自的优缺点,只要根据提取物的性质及其杂质、提取成本、工艺设备等条件,选择合适的提取工艺,就可以提高黄酮类化合物的得率,从而降低生产成本,提高原料的利用率。
相信随着研究的不断深入，黄酮类化合物的提取分离技术必将进一步得到完善。
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