Elisa技术原理和相关概念全整理.docx
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Elisa技术原理和相关概念全整理
一、免疫分析技术基本原理
利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法
抗原：
可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。
按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。
抗体：
由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。
分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD五个亚型。
不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。
不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。
抗原抗体反应的特性
1、可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：
K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性
2、特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
3、最适比例
4、敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平。
酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。
免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。
酶联免疫敏感度可高达pg-ng/ml水平。
例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
二、固相免疫测定的原理
基础：
抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
双抗原夹心法
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
间接法
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
竞争法
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
俘获法
IgM的检测常用于传染病的诊断。
用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。
此法常用于病毒性感染的早期诊断。
生物素－亲合素法
①固相支持物→②固相化抗原→③特异性IgG（待检物）→④生物素化抗小鼠IgG（Biotin）→⑤HRP-酶标链亲和素（Avidin）→⑥底物及显色剂→⑦显色和测定。
三、免疫检测相关概念
1、样本、标本、临床标本
样本：
在统计里，我们把所要考察对象的全体叫做总体，其中每一个考察对象叫做个体，从整体中所抽取的一部分个体叫做总体的一个样本。
样本是一个统计学的概念，样本往往不只包含一个个体。
标本（Sample，S）：
在给定的考察或测量方法中的具体测量对象，往往和统计学的个体等价。
例如在ELISA实验里，HCG有测血样的也有测尿样的，对应的血样或尿样叫这个测量方法的标本。
临床标本：
在检验技术中，直接从机体采集的，经过处理而适用于临床检验的标本。
例如从人体采集的抗凝血清叫临床标本，而经过稀释或浓缩的标本只能称为稀释标本或浓缩标本而不能称之为临床标本。
2、医学决定水平
医学决定水平（Medicine decide level ，MDL）：
是指不同于参考值的另一些限值，通过观察测定值是否高于或低于这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认的作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出估计，以提示医师在临床上应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查，或决定采取某种治疗措施等。
随着检测技术的进步，某一检测指标检测灵敏度的提高，临床意义的改变，往往能改变某一疾病的医学决定水平。
例如某些激素项目的超敏试剂盒能帮助医师判定疾病的进程及处理对策。
3、金标准
金标准：
现有条件下最科学最准确的标准。
在检验学中指的是某种疾病标志物的确证实验。
如菌体培养，组织切片，组织活检，抗体条带免疫印迹（WB），核酸诊断等。
ELISA方法往往只检验某种疾病众多表征或标志物中最具代表性或最具操作性的一种或几种，即通常所说的初筛实验，追求的是灵敏、简便和快速，而这些表征或标志物的检出不能确证患病与否，所以需要更进一步的确证实验。
4、对照实验
对照实验（controlexperiment）：
一般进行某种实验以阐明一定因于对一个对象的影响和处理效应或其意义时，除了对试验所要求研究的因子或操作处理外，其他因素都保持一致，并把试验的结果进行比较，这种试验称为对照试验。
目的是通过对比实验的结果找到想要研究的因素对实验的影响作用，从而为科学的研究提供事实依据和直接证据。
对照实验有对照组和实验组。
有以下常见的类型：
1）、空白对照：
即不作任何实验处理的对照组。
2）、自身对照：
即实验与对照在同一对象上进行，不另设对照组（通常意义上的重复）。
3）、条件对照：
即给对象施以某种实验处理，但这种处理不是实验假设所给定的实验变量。
例如我们通常在进行配方改进的时候，所改变的条件相对于原来的配方来说就属于条件按对照。
空白（blank，BL）
空白实验（blanktest）和空白样品：
空白试验指对不含待测物质的样品，用与实际样品同样的操作进行的试验。
对应的样品称为空白样品（简称：
空白）。
现场空白和实验室空白：
现场空白指带到监测现场而模拟现场监测过程的空白样品。
实验室空白指没有带到监测现场的空白样品。
标准空白、试剂空白和全程空白：
标准空白是指配标准溶液（标准系列溶液）时“零”浓度的空白，或不添加标准物质的空白。
试剂空白是指随同试样分析步骤的空白样品。
全程空白即全程试剂空白，是指经历试样分析全部步骤的空白样品。
5、本底/非特异结合
本底（background）：
亦称背景，指某一测量方法中阴性样本的信号值或计数值。
非特异结合（nonspecificbind，NSB）：
由非待检物产生的有用检测信号。
表现形式为高本底阴性或阳性。
6、阳性、阴性及界定
1）、阳性/假阳性
阳性（positive，P）：
在给定的某一判定标准下，某一测量结果符合存在条件的称为阳性。
例如ELISA实验中规定，标本的测量结果大于界值判定为阳性。
假阳性：
真实结果不满足存在的条件，由于某些因素的干扰，导致测量结果满足存在条件的称为假阳性。
在表述阳性或者假阳性时，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。
例如，我们经常说某人HCV阳性，严格的说这是一个不规范的说法。
因为可以理解为这么多的意思：
此人是丙肝患者；此人HCV抗原阳性；此人HCV抗体阳性（可能是患者也可能不是患者）；此人HCVRNA阳性等等。
2）、阴性/假阴性
阴性（Negtive，N）：
在给定的某一判定标准下，某一结果不符合存在条件的称为阴性。
假阴性：
真实结果满足存在的条件，由于某些因素的干扰，导致测量结果不满足存在条件的称为假阴性。
在表述阴性和假阴性时，和表述阳性/假阳性一样，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。
7、CO值
CO值（CutOffValue，CO）：
界值或阳性判定值，指某仪测量方法中用于区分阳性和阴性的数值。
有两种判断方式：
一种是大于CO值判为阳性，否则为阴性，常见于ELISA实验中除竞争抑制法以外的方法，判断方法较为直观；另一种是小于CO值判为阳性，否则为阴性，常见于ELISA实验中的竞争抑制法，判断方法不直观，要求测量方法稳定且重复性好。
CO值的计算方式：
往往以某一常数加上或乘以一个变量，变量的变动范围较小，常数反映本底信号，变量反映多次测量之间的差异。
例如，某公司HIV试剂盒CO值计算公式：
CO=NC+0.1（NC＜0.05时按照0.05计算）。
CO值的设定：
通常采用数理统计学的方法，即测量大量的阴性样本，测量结果呈正态分布，取95%或99%为置信区，取置信区上限为CO值。
8、S/CO值或P/N值
S/CO值：
即样本值和界值的比值，相当于一个半定量的判断。
在ELISA检验中，S/CO值的判断方法比将样本值和CO值直接比较更具科学性，在不同厂家试剂对比实验时往往用S/CO值而不是OD值。
做长期动态的观察时（例如做质控图），用绝对的OD值做质控图不能准确的反映实验环境给实验带来的影响，而S/CO值则能尽量的减小这种影响。
P/N值：
有两种说法，一种是标本值和阴性对照的比值，是早期采用的定性判断方法；另一种是患者测量值（阳性值）和正常人测量值（阴性值）的比值。
第二个个概念比较有用，它反应的是试剂的阴阳反差，即有用信号和背景信号的区分能力，一定程度上体现了试剂灵敏度的高低。
定性试验检测报告方式：
为便于统一计算，国内外一般按S/C.O方式报告，S为标本A值，C.O即CutOff值（阳性判定值）
CutOff的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：
C.O=2.1×N（当N不足0.05时按0.05计），此公式由P/N>2.1换算而来，常用于夹心法。
C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来，常用于竟争、中和法
C.O=N+C（C为常数），用于间接法。
C.O=C×P+N（C为常数），用于间接法。
此公式最客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。
9、标准品、校准品
标准品：
1）、国际标准品：
由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。
如FDA的标准品。
2）、国际生物学活性标准品：
根据生物学反应，由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。
3）、参考标准血清：
国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。
可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。
如HBsAg的国家标准血清盘。
校准品：
使测量值具有可比性的对照物质。
对于测量血清标本的检验手段来说，最佳的校准品应该是用决定性方法定值的新鲜混合血清。
校准品具有系统专一性，不同系统的校准品不能混用（例如不同厂家或者不同批次的“标准品”不能替换使用）。
我们定量产品中通常所说的标准品严格以上来说应当叫校准品，校准品往上溯源才是标准品。
ISO17511对控制品有较为详细的说明。
10、质控品/内控品
质控品（control）：
是已有靶值的对照物质，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。
质控品检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。
如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。
体外诊断（IVD）行业中，通常使用的质控品有卫生部临床检验中心（NCCL）提供的定值质控品。
在临床实验室中，经常使用各省疾控中心（CDC）发放的定值质控品。
各临床实验室每年还在第三方（通常由各省的相关领导部门担任）的组织下进行室间质评，以评价实验室的总体检验水平。
内控品：
参照权威机构标准品或质控品，由实验室自己标定的对照物质，用于控制本实验室的实验误差。
质控品和内控品都要保证其溯源性！
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11、成品、半成品、中间品
成品：
通俗来说就是符合客户要求和满足法律法规要求，可以直接交货或售卖的产品。
比如试组装完毕、检验合格，贴上合格签的试剂盒。
对于国家批批检的产品，必须还要有国家相关检验机构出具的合格检验报告，并经过相关机构做出合格标示的试剂盒才能算成品试剂盒。
成品与半成品是公司内对生产流程的分类，可是对外，就没有什么成品和半成品之分了，如果客户要买你的“半成品”，那么“半成品”也就变成你们的成品了，如果客户不买你的“成品”，那么你的“成品”则连半成品也不是！
所以我们一定要把东西卖出去。
半成品：
通俗来说，品质要求已达到客户要求，但还需要经过一道或几道后序加工程序才能成为成品的产品，通常的后序加工程序指的是组装。
例如：
检验合格的包被板，分装并检验合格的酶结合物和标准品等。
中间品：
半成品生产过程中所处的合格的形态。
例如：
包被后检验合格的包被板，分装前检验合格的酶结合物和标准品。
无论是成品、半成品还是中间品，必须强调检验合格的概念！
12、质量检验
质量检验：
对产品的一个或多个质量特性进行观察、测量、试验，并将结果和规定的质量要求进行比较，以确定每项质量特性合格情况的技术性检查活动。
质量检验的职能：
鉴别、把关、预防、报告、监督。
质量检验的步骤
（1）检验的准备。
熟悉规定要求，选择检验方法，制定检验规范。
在检验的准备阶段，必要时要对检验人员进行相关知识和技能的培训和考核，确认能否适应检验工作的需要。
（2）测量或试验。
按已确定的检验方法和方案，对产品质量特性进行定量或定性的观察、测量、试验，得到需要的量值和结果。
测量和试验前后，检验人员要确认检验仪器设备和被检物品试样状态正常，保证测量和试验数据的正确、有效。
（3）记录。
对测量的条件、测量得到的量值和观察得到的技术状态用规范化的格式和要求予以记载或描述，作为客观的质量证据保存下来。
质量检验记录是证实产品质量的证据，因此数据要客观、真实，字迹要清晰、整齐，不能随意涂改，需要更改的要按规定程序和要求办理。
质量检验记录不仅要记录检验数据，还要记录检验日期、班次，由检验人员签名，便于质量追溯，明确质量责任。
（4）比较和判定。
由专职人员将检验的结果与规定要求进行对照比较，确定每一项质量特性是否符合规定要求，从而判定被检验的产品是否合格。
13、质量控制、质量保证
质量控制（QuailityControl，Q.C）：
质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。
这一过程是通过一个反馈环路进行的。
1）确定控制的对象；
2）规定控制对象的标准（预期值）；
3）制定或选择控制方法和手段；
3）测量实际数据；
4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。
超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
5）采取行动，解决差异。
恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。
质量保证（QualityAssurance，Q.A）：
提供质量要求会得到满足的信任的一系列活动。
质量保证的关键词是“提供信任”，提供信任的对象对内可以是管理者，对外可以是顾客；“提供信任”的方法是需要提供能够证实质量要求会得到满足的证据。
对内或对外提供产品质量保证文件、过程监控记录、质量手册或认证证书，都可以作为“提供信任”的方法。
14、基质效应、基质偏差
基质效应（matrixeffect）：
基质指的是样品中被分析物以外的组分，基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。
基质效应表现在两个方面：
1）、标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。
2）、基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。
基质偏差（matrixbias）。
基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。
用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。
基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。
国外已有不少文献指出某些在制备过程中经过加工或添加某些成分（如制备的LDL）的参考血清，会在某些分析系统中出现基质效应（matrixeffect），而使标本（新鲜血清）的分析结果出现明显偏差。
用新鲜血清为参考材料是最理想的，但显然是不现实的，所以对参考材料的研制又提出了新的难题。
Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：
改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。
改进仪器设计及试剂组成。
选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。
15、HOOK效应
高值钩镰效应（HD-HOOK）。
在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂（HIGHDOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）根据此现象写实性地称之为“HD-HOOK”效应。
在一步法和两步法中均有HOOK效应
一步夹心法HOOK效应
实际上是一种“浓度效应”，待测物中抗原数量过高所致，次要因素：
标记抗体与被捕捉抗原的交叉重叠结合而导致抗原变构。
只要靶抗原的正常值与病理值之差大于3个数量级，均应警示由于严重的“HD-HOOK效应”而发生的假阴性，假低值。
两步夹心法HOOK效应
仅发现于少数具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原如：
SF、AFP、PSA、HCG等）。
随着杂交瘤单抗的问世，Femando等设计了一个堪称现代经典的实验模式，使这一课题的研究取得了突破性进展。
所选用的试验方法是二步IRMA，靶抗原是一个已知其WM为22kDa、仅有二个不同抗原簇的人生长因子（hGH）。
一个单抗用于包被，另一个作125I标记作二抗。
用此实验系统，测定单体hGH抗原时，没有发现“HD-HOOK效应”问题奇怪的是，用同样实验系统，测定非共价结合的二聚体（D）-hGH则呈现了“HD-HOOK效应”。
据此实验结果，推导出一个新理论：
即标记二抗介导被捕捉抗原分子发生分子变构‘（Confromationalchange）’，使之形成标记二抗与变构的抗原分子复合物，从固相一抗上解离，最终产生反应信号减低的“HD-HOOK”效应。
这种“抗原分子变构理论”的核心是抗原的“质”的问题。
理论依据
首先，大分子蛋白质抗原的可变构性是决定性的内因。
其中构象性决定簇是几条肽链（非连续性）提供的氨基酸组合而成的，比线性（连续性）决定簇的稳定性差，易发生变构。
其次，蛋白质分子内非共价结合键，也是发生分子变构的内在因素。
从现有资料看，仅报道铁蛋白、AFP、PSA及HCG等，具有多重决定蔟的大分子抗原，在二步法中产生“HD-HOOK效应”。
小分子抗原则否。
表明抗原“质”的特性是关键性因素。
再次，抗体分子是介导抗原分子变构的重要外因。
已知Igs分子在遇到相应抗原时，为了执行其固有的（本质性）生物学功能，其分子的Fab臂可围绕铰链区，作变角折弯（>100°）、锥形转动以及最N末端的可变区，依托Fab的恒定区作微小的“球穴”摆动。
当其与被捕捉抗原分子之间，发生交差重叠结合之后，由于“立体效应（stericeffect）”，加之标记二抗的亲和力大于一抗等辅助因素，是可以迫使已被捕捉的抗原分子从一抗上解离洗涤出去的。
很可能与这些因素有关：
包被抗体亲和力低、洗涤不合适、酶标抗体不足、过度孵育、其他非特异性反应。
16、窗口期
窗口期（windowperiod）：
病毒感染后，病毒出现在血液中直到可以检出足够多的相应病毒标志物（抗原或抗体）前的时期。
在这段时间内，血清中无法检测出相应的抗原抗体标志物。
各种病毒的窗口期是不一样的，一般所称的窗口期指的是检测到病毒抗体的时间，但抗原以及核酸检测同样存在窗口期，但时间大大缩短。
HBV、HCV、HIV的窗口期的时间分别为56、70和22天，P24抗原的窗口期平均为15天，而应用核酸技术，可分别将HBV、HCV、HIV的窗口期缩短为41、12、11天。
由于检测技术的局限，某种检测结果为阴性并不意味着就没有感染，因此定期复查是非常重要的。
相信随着检测的病毒标志物的不同，检测技术的提高，可大大缩短窗口期时间。
17、潜伏期
潜伏期（incubationperiod）是指病原体侵入机体到最初出现症状和体征之间的这段时期。
各种疾病的潜伏期长短不一，短者数小时，长者可达数月或数年。
如禽类禽流感的潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。
人类患上禽流感后，潜伏期一般为7天以内。
非典型性肺炎的潜伏期一般在4~10天，临床报告最短病例为1天，最长有20天，甚至有极个别病例达到28天。
一般认为潜伏期长短与感染病毒的种类或者型别、病毒的致病性、病毒的数量、感染途径、被感染机体的免疫力以及其他非生理因素等有关。
比如艾滋病病毒，经输血感染的剂量一般较大，所以潜伏期相对较短，而性接触感染艾滋病病毒的剂量较小，因此潜伏期相对较长。
HBV感染后的潜伏期一般为20天至6个月，也有报道28~160天，平均70~80天；HCV感染后临床表现一般较轻，常为亚临床型，但输血后感染的潜伏期一般为20天至6个月，也有资料报道2~26周，平均8周；HIV感染后1到2个月内可能出现急性的症状和体征，随后进入较长的无症状期，持续6—15年，平均8—10年，大量输血的可缩短至1~5年。
梅毒的潜伏期一般为2~4周
18、灰区
灰区：
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种：
1）C.O×（1±CV），CV为该试剂的批内CV（一般在15-20%间）；
2）C.O±2s，s为实验室做室内质控ROC（受试者工作特征曲线）的s。
CV（CoefficientofVariance）：
标准差系数，变异系数的一种表示方式是标准差与均值的比率，反映单位均值上的离散程度；
s（StandardDeviation）：
标准差，也称均方差（meansquareerror），是各数据偏离平均数的距离的平均数，它是离均差平方和平均后的方根，用σ表示。
标准差是方差的算术平方根。
标准差能反映一个数据集的离散程度。
19、酶免疫吸附实验（EIA）的性能指标（定性产品）
1）、灵敏度
灵敏度（sensitivity）：
某一检测系统检出极低被检物质的能力。
包括两层意思：
a、检出被检物质最低量的能力：
常用检出最低量被检物的含量（即分析灵敏度或最低检出限）来表示。
比如0.1ng，0.1mIu，0.1NCU等，意思是在某一检测方法下，检测系统能将有用信号和背景信号区分开来时所对应的被检物的浓度。
但这种区分在目前的条件下是否在临床上有确切的意义并不能全部的肯定。
评价方式：
用标准被检物持续稀释，直到能区分有用信号和背景信号的最大稀释倍数。
也叫滴度。
在ELISA实验里，常用强阳性混合血清系列稀释，同时用市场反应较好的试剂盒同时进行标定，选择这些试剂盒都能检出的最大稀释倍数的血清作为灵敏度血清，通常会有成系列的几个血清。
在标定系列灵敏度血清的时候要非常注意一个问题：
要注意基质效应在不同系统（包括不同厂家的试剂盒、工艺、不同原材料）上对灵敏度血清测量值的影响，在改变系统时，必须重新标定灵敏度血清。
b、为试剂对人群或大量样品中阳性标本检出的能力（假阴性越少越好），取决于包被物的全面性和亲和力。
选择原材料一定要选择亲和力高的原料。
有些厂家为追求试剂对大多数阳性标本的灵敏度，只选择最强的一种或少数几种优势表位，而牺牲了在患者人群中较少出现的亚型或者原材料片段，这种做法是非常危险的，是对目标人群的不负责任。
（是不是说在双抗夹心法中，采用多抗包被
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