分子生物学实验指导1.docx

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分子生物学实验指导1

第一部分分子生物学实验入门

一、实验室规则

（一）实验室安全规则

1．水电使用安全规则：

注意节约用水（不管是自来水还是纯净水），清洗器皿时，先用自来水洗干净后，根据实验需要再用纯净水冲洗l～3遍；随时注意水龙头是否关掉，水池是否堵塞、漏水；注意节约用电，不能随意调节空调，仪器使用前应了解是否漏电、短路，使用完后按操作程序关掉电源；最后离开实验室的同学应检查实验室的照明灯、仪器电源、水龙头是否关掉。

2．药品使用安全规则：

易燃易爆药品远离火源；注意有毒或腐蚀性药品—的使用方法；绝对禁止药品、试剂间的相互污染；废弃液体入水池后用水冲掉，固体废弃物严禁入水池；有毒废弃物倒到指定地点。

3．仪器使用安全规则：

实验室任何仪器不能随意操作，严格按照操作规程进行；仪器在使用过程中出现故障要报告，不能自行处理；使用完仪器后要清洁仪器和台面并记录仪器使用情况。

（二）实验室卫生规则

1．维护实验室的清洁卫生：

不能随地吐痰，乱扔废纸屑等物品。

每小组实验完后清洗器皿和清理台面。

2．严格执行卫生值日制：

实验完后实验室的清洁卫生由值日小组按照布置严格执行，不能无故不做。

（三）学生守则

1．每位同学都应衣冠整齐，自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不得无故迟到早退，保持室内安静。

2．注意实验室环境、仪器和实验桌面的整洁，每次实验完成后该清洗的器皿清洗完后按原位放好，经老师检查后方可离开。

3．每次开始做实验前，应预习好实验指导，要充分了解实验原理、方法及仪器设备的使用方法，原则上按照实验指导的方法进行，如经预习，查资料后，有更好的实验方法，可与老师讨论后进行，鼓励创新。

4．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂。

5．注意安全。

易燃易爆物远离火源，注意有毒或腐蚀药品的使用方法，玻璃器皿的使用、洗涤，尽可能减少损坏、割伤手。

行走时不要碰撞他物。

废弃液体倒入水槽并用水冲走，固体废弃物严禁入水槽，应丢入垃圾桶中。

6．实验室的清洁卫生及安全值日，经老师或班长安排后，严格执行。

7．应注意同学之间相互协作能力方面的培养。

8．真实认真地对待每次实验，记录好实验结果，实验完后，交实验报告或签名后方可离开。

二、常用仪器的使用方法

（一）离心机

离心机种类很多，有大型落地式的冷冻离心机，非冷冻台式离心机；按转速分为：

超速、高速、低速离心机等，主要是由冷冻装置、调速装置、转轴、转头等组成。

其基本操作过程如下：

1．转速调到零位，接通电源。

2．是冷冻离心机则调温度为所需温度，冷机开始工作。

3．将所离心的物质于离心管进行平衡后，放于转头相对应位置。

4．盖好转头盖和外盖，调转速为所需转速，高速时注意离心力与转速的换算RCF=1.119x10-5x半径x转速（r／min），调所需的离心时间。

5．启动离心机，进入离心过程。

6．到了时间，转速指示为零时，打开离心机盖，小心拿出离心管（防震动）。

7．使调速旋钮为零位，断电，清洁离心机。

不同离心机的使用方法，请看各自说明书。

（二）微量移液器

每一把移液器都有一定的移液范围，使用之前请选择。

1．用旋钮调节到所需要的体积刻度，注意，使用旋钮时，绝对禁止超出刻度范围。

2．选择吸头牢固地装在管嘴锥上，注意，保证吸头上无任何异物。

3．当移液管、吸头和溶液的温度一致时，开始移液。

4．将按钮压至第一停点位置。

5．将移液管吸头浸入液面2—3mm深处，然后慢慢吸入液体。

当吸头吸满液体后，将吸头撤出液面，擦掉吸头外侧的所有液滴。

注意，不要触及吸嘴口。

6．轻轻压下按钮至第一停点位置，放出液体。

约一秒钟后，继续将按钮压至第二停点位置。

待吸管液体放干净后，将吸头贴在容器壁上防止形成液滴滴入瓶中。

撤出吸头。

7．松开按钮使之回到起始位置。

必要时换掉吸头以同样的操作吸另一种溶液。

（三）电子天平

电子天平型号不同，称量范围、灵敏度等也不同。

可以参看各自型号的说明。

下面以DT200为例介绍操作方法。

1．接通220V电源（应有良好地线），打开电源开关，此时，天平内部电源开始工作，而微机处于不工作状态不显示。

2．在空称盘时，按一下ON／OFF键，显示窗内绿色显示器全亮88888后，接着依次显示E-1至E-9，表示微机正在检查天平各个部分，然后，显示0.0g，下面可进入正常称量工作（为保证称量稳定，天平应开机后预热15min后称量）。

3．当称盘上放皮重时待天平显示稳定后按一下去皮键T显示值为0.0g后再称量，显示为净重。

拿掉载荷后，显示载荷的负值，再按一下去皮键，显示回零值。

4．称量完后，关掉电源，清洁天平。

三、器皿的洗涤及要求

（一）一般实验要求

1．初用玻璃器皿的洗涤

新购买的玻璃器皿表面常附着有游离的碱性物质，可选用洗衣粉（或去污粉）洗刷，再用自来水洗净（洗净的标志是器壁不挂水珠或无油污迹象），然后浸泡在1％一2％盐酸溶液中过夜（不少于4h），再用自来水冲洗，最后用蒸馏水或去离子水洗2～3遍（此目的是洗掉器皿表面的自来水，用少量多次法，注意节约用水），自然控干或在60～100℃烘箱内烘干备用。

2．使用过的玻璃器皿的洗涤

（1）一般玻璃器皿，如试管、烧杯、锥瓶、量筒等，先用自来水洗刷至无污物，浸泡于洗衣粉水（或用毛刷沾取去污粉于壁内外），再用大小合适的毛刷细心刷洗（禁止粗暴洗而损坏器皿），用自来水冲洗干净，观察是否干净（同上标志）后，用蒸馏水或去离子水冲洗2～3遍，自然控干或烘干备用（难以洗去的污物，可选用适合的洗液浸泡涮洗）。

（2）量器，如吸量管、滴定管、容量瓶等。

使用后应立即浸泡于水中，勿使物质干涸。

使用完毕后用流水冲洗，以除去附着的试剂、蛋白质等物质，控干后浸泡在铬酸洗液中4～6h（或过夜），再用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3遍，风干备用。

（3）其他，如装过传染性样品的容器（病毒或微生物、病人血清等），应先进行消毒（高压等方法）再进行如上的洗涤。

（二）分子生物学实验要求

1．所有玻璃制品洗涤方法同上，但均需高压灭菌，而买来的塑料制品不少已经灭菌，要看说明，有些塑料制品不能高压灭菌（可能会变形等），要用丁射线灭菌（这些基本上是厂家已经灭菌好的一次性用品，现在常使用的小离心管和吸头均可进行高压灭菌。

2．某些特殊实验（如处理极小量的单链DNA或用Maxam-Gilbert法进行测序），则以使用覆盖有硅甲烷薄层的玻璃或塑料制品为宜。

具体操作如下：

（1）将待硅烷化的物品（吸头、试管、烧杯等）放入一个大的玻璃干燥器内。

（2）干燥器内放置一小烧杯，内装1ml二氯二甲硅烷（小心，此物有毒和挥发性，务必在通风橱中进行）。

（3）通过接液瓶将干燥器与真空泵相连，开启真空系统抽气至二氯二甲硅烷开始沸腾，立即切断真空泵与干燥器之间的连接管道，关闭真空泵。

干燥器应维持真空状态（一旦二氯二甲硅烷开始沸腾，必须马上关闭真空泵，否则，挥发剂将被抽入真空泵而无法挽救地破坏真空泵）。

（4）待二氯二甲硅烷挥发至尽（1～2h），在化学通风橱中打开干燥器。

让二氯二甲硅烷烟雾分散后，取出器皿，玻璃制品和玻璃棉使用前应于180℃烘烤2小时。

塑料制品不应高压灭菌，但使用前须用水彻底冲洗。

大件玻璃制品的硅烷化是把物品用氯仿或庚烷配制的5％二氯二甲硅烷浸泡或漂洗，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上，用前反复冲洗多次或于180℃烘烤2小时。

四、实验结果的记录及保存

准备一个实验记录本，将预习和阶段性结果或最后结果记录于此。

应真实记录实验结果。

生物化学与分子生物学实验的结果有数据、现象和图谱。

1．数据的记录

在预习中列表格。

实验中，一个样品最少测2次并求平均值。

有的实验要求对单次测量结果求出相对偏差、平均偏差、标准偏差、相对标准偏差等，可按有关公式计算。

2．现象的记录

在记录本中如实描述所产生的现象。

3．图谱的记录

如电泳后的结果，可以通过照相或描画（根据实验室条件进行）。

每次实验结果记录完成以后，样品（如试管中的溶液、电泳凝胶等）保存一段时间，与所记录的结果核实一遍，确认无误后，冲洗掉或弃去。

如是阶段性结果，后面的实验还要用，应封闭后（根据不同温度要求）于冰箱冷冻或冷藏保存。

五、实验报告的完成

阶段性的实验不要求写实验报告，一个大实验完成以后，写综合性的实验报告（如同论文的形式），格式为：

标题（4号字）

姓名、学号、班级（5号字）

摘要及关键词（小5号字）

引言

进入正文：

1材料与方法

1．1材料

1．1．1材料

1．1．2试剂

1．2方法

2结果，

3讨论

六、实验成绩评分方法

实验操作30％（实验前是否有预习、实验是否积极参与、器皿仪器是否会用等）。

实验报告40％（是否按格式写、是否简明扼要重点突出、结果好坏及讨论是否正确）。

实验素质20％（是否遵守实验室规则和学生守则）。

实验考试10％（根据实验中出现的问题临时决定方式）。

第二部分分子生物学实验

实验一质粒DNA的提取

【目的和要求】

1．学习载体的基本结构。

2．了解碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想。

3．掌握提取质粒实验中的各项基本技术。

4．提取载体和含插入片段的供体质粒。

【实验原理】

基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。

目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒等载体。

载体必须具备以下基本条件：

1．复制子：

一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制繁殖。

2．有一个或多个利于检测的遗传表型：

如抗药性、显色表型反应。

3．有一个或多个限制性内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。

4．适当的拷贝数：

较高的拷贝数有利于载体的制备，使细胞中克隆基因的数量增加。

质粒是基因工程中的常用载体之一，是染色体外小型的双链环状的DNA，大小在l～200kb之间，可自主复制，每个细胞拷贝数可达500～700个。

如典型的pUC系列质粒载体pUCl8，它含有pBR322的复制起始位点，ampr以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因lacZ的启动子及其编码α肽链的DNA序列，并有一段多克隆位点区段（MCS）。

当外源DNA插入时，形成无活性的半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌就在X-gal-IPTG平板上形成白色菌落，当没有外源基因插入时则形成蓝色菌落。

质粒DNA的提取是基因工程操作中最常用与基本的技术，已有多种方法可供选择。

例如利用碱性或煮沸条件下质粒DNA和染色体DNA变性、复性的不同来进行分离的碱法；利用EB（溴化乙锭）插入造成不同构型的DNA浮力密度不同的CsCl法；利用在酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布而开环和线性分子在酚相中分布进行分离的酸酚法；以及现在利用玻璃纤维膜吸附DNA的快速抽提法等。

质粒提取一般步骤如下：

细菌培养物的生长，细菌的收获和裂解，质粒DNA的纯化等，通常用离心的方法去除各种细胞碎片，用饱和酚处理去除蛋白质，用RNA酶处理去除RNA等，最后用乙醇沉淀达到浓缩的目的。

一般lml菌液可获得约3～5μg质粒DNA。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

【教学内容】

1．质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍。

2．碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒。

【实验器材和试剂】

1．器材

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、振荡器、恒温水浴、微量移液器（20μl，200μl，1000μl）、1.5mlEnpendorf管。

2．材料与试剂

（1）LB液体培养基：

酵母提取物5g／L，蛋白胨10g／L，NaCl10g／L，pH7.0。

（2）氨苄青霉素：

100mg／m1分装后于-20℃保存。

（3）溶液I

50mmol／L葡萄糖

5mmol／L三羟甲基氨基甲烷（Tris-C1）（pH8.0）

10mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

（4）溶液Ⅱ

0.2mol／LNaOH，1％SDS，新鲜配制，如有絮状沉淀可放在温水浴中助溶，不澄清者不可用。

（5）溶液Ⅲ

5mol／L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，H2O28.5m1

溶液I、Ⅱ、Ⅲ可按1：

2：

1.5的比例配制。

（6）饱和酚（pH8.0）

（7）酚氯仿（25：

24）

（8）氯仿异戊醇（24：

1）

（9）无水乙醇

（10）70％乙醇（-20℃保存）

（11）RNaseA：

5mg／ml，100℃煮沸10min，自然冷却至室温，分装小管，-20℃保存。

（12）TE缓冲液：

10mmo1／LTris-HCl，1mmol／LEDTA

3．菌种：

含供体（含目的基因）和载体质粒的大肠杆菌。

【实验方法】

1．挑取菌种接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2．取1.5ml培养物倒入微量离心管（EP管）中，12000r／min离心lmin，弃上清液。

3．重复上述步骤1次。

4．将细胞沉淀悬浮于100μl溶液I中，剧烈振荡，充分混匀（振荡至无菌块）。

5．加200μl溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速颠倒混匀内容物，确保离心管内表面均与溶液Ⅱ接触，将离心管放冰上10min。

6．加150μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰上放置l0min。

7．12000r／min离心10min，将上清液转至另一EP管中（作好标记）。

8．加入450μl酚：

氯仿，混匀，12000r／min离心5min，吸取上清液至另一EP管中。

9．加入450μl氯仿：

异戊醇，混匀，12000r／min离心5min。

10．吸取上清液至新EP管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置15min。

11．12000r／min离心10min，弃上清液。

12．用lml70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，略振荡后放置2min，12000r／min离心2min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体，空气中干燥5min。

13．加20μlTE缓冲液，其中含有50μg／ml的RNaseA，振荡使DNA溶解，65℃放置30min，去除RNA。

14．标记后，置-20℃保存备用。

【注意事项】

1．微量加样器的正确使用。

（1）选择一支量程合适的移液器，设置移液量。

（2）装枪头，检验移液量。

（3）吸取一定体积的液体，目测吸入枪头的液体体积是否合理。

（4）释放液体，退下枪头。

2．溶液I加入后充分悬浮。

3．溶液Ⅲ加入后轻柔地颠倒混匀。

4．酚抽提后小心吸取上清液。

实验二DNA限制性内切酶酶切反应

【目的和要求】

1．了解一般限制性内切酶的各种特性；

2．学习设计酶切方案的一般规律；

3．掌握酶的保存与使用方法；

4．对载体与供体进行酶切。

【实验原理】

限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、Ⅱ型、Ⅲ型三类，Ⅱ型限制性内切酶识别含4～7个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片段，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。

在分子克隆中I、Ⅲ类型限制性内切酶都不常用。

影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等，只有正确选用酶反应条件才能达到最佳酶切效果。

此外DNA制品中的污染，如RNA、蛋白质、氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇、琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等均能抑制酶切活性，影响酶切效果，这种抑制可通过增加酶作用单位数，增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。

酶切计划的实施可按以下次序进行：

DNA量→酶量（最多占总体积的1／10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。

一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5μg／50μl。

酶切时加样顺序一般应为：

水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。

向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离心5min后保温酶切。

【实验器材和试剂】

台式离心机、振荡器、恒温水浴、微量移液器（20μl，200μ1，1000μ1）、1.5m1Enpendorf管、限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水。

【实验方法】

1．酶切

取一EP管，分别加入以下成分：

无菌ddH2O2.5μl

10×bufferH1.5μl

质粒DNA5μl

BamHI0.5μl

SalI0.5μl

总体积20μl

2．混匀后，离心5s，37℃酶切3h。

3．电泳检测酶切结果。

【注意事项】

1．酶切反应用的Eppendorf管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。

使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。

2．DNA样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

3．要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶。

4．取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。

待用的酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。

5．当样品在37℃保温时，要将Eppendorf管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密使水进入管内，造成实验失败。

实验三琼脂糖凝胶电泳

【目的和要求】

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

【实验原理】

DNA的电泳分离技术是基因工程中的一项基本技术，也是DNA、RNA检测和分离的重要手段。

琼脂糖凝胶电泳具有快速、简便、样品用量少、灵敏度高以及一次测定可获多种信息等特点。

DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。

在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。

DNA片段的迁移率与分子大小及高级结构有密切关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同，但构型不同的DNA分子。

如质粒的三种构型的泳动速率不同：

超螺旋闭合环状质粒最快，线型质粒其次，开环质粒最慢。

影响DNA泳动速率的因素很多，如分子量大小与DNA构型、凝胶浓度、电场强度、EB、电泳缓冲液等。

分子量标准是在电泳测定DNA样品的分子量及浓度的过程中所使用的标准样品对照。

常用类型：

λ-HindⅢ，λ-HindⅢ／EcoRI，DNAladder，PCRmarker等等，选用的原则是构型与被测分子相同，标准片段分子能包含被测分子，此外某些分子量标准使用前需要进行预处理。

不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNA分子的有效范围见下表：

琼脂糖凝胶浓度（％）

分离范围（kb）

0.3

5～60

0.6

1～20

0.9

0.8～10

1.0

0.5～7

1.2

0.4～6

1.5

0.2～3

2.0

0.1～2

【教学内容】

1．电泳基本知识介绍。

2．琼脂糖凝胶的制备。

3．电泳检测质粒DNA及其酶切产物。

4．质粒及其酶切产物的定量。

【实验器材和试剂】

1．琼脂糖凝胶电泳系统

2．电泳仪，电泳槽一套

3．微波炉

4．台式离心机

5．紫外透射仪

6．50×TBE电泳缓冲液：

242.0gTris，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），57.1m1冰醋酸，加水至1000ml。

4℃保存，用时稀释50倍。

7．6×加样缓冲液（2.5g／L溴酚蓝+400g／L蔗糖+10mol／LMEDTA）

8．琼脂糖

9．溴化乙锭（EB）：

lmg／ml母液，使用浓度0.5μg／ml

10．DNAmarker（λDNAHindⅢ／EcoRI）

11．质粒DNA

12．EcoRI

【实验方法】

1．制胶

（1）将制胶槽两端用胶带封严。

（2）称取0.2g琼脂糖于三角瓶中，加入20mll×TBE。

（3）用微波炉加热融化至完全溶解，无颗粒状琼脂糖。

（4）摇匀，倒入制胶槽中直至形成均匀的胶面，注意不要形成气泡。

（5）临用前，待凝固拔取梳子，撕去胶带，放入电泳槽，倒入适量（80m1）1×TBEbuffer至电泳槽中，备用。

2．样品准备

取Marker2μl（0.5μg）、酶切样品5μl和2μl质粒原液分别与6×加样缓冲液混匀后，加样。

3．记录点样顺序和点样量。

4．电泳：

接通电泳仪和电泳槽的电源（注意点样孔应在负极），恒压80V，电泳约30min。

5．把凝胶浸入EB溶液染色20min。

6．紫外灯下观察并记录结果。

7．分析结果并鉴定样品纯度。

实验四目的基因的PCR扩增

【目的和要求】

1.学习PCR体外扩增DNA的原理及引物设计的原则。

2.了解扩增过程各因素对扩增结果的影响。

3.掌握PCR法的基本操作步骤。

【实验原理】

PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA技术。

其原理类似DNA的天然复制过程，是以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在待扩增的DNA片段两侧与其互补的两个引物，在酶的作用下经高温变性、低温退火和中温延伸若干个循环，进行互补链的延伸，使DNA成对数级增加。

（1）变性（Denature）:

加热使模板DNA在高温（94℃）下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链DNA。

（2）退火（Anneal）:

使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基互补配对原则互补结合。

（3）延伸（Extension）:

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′-3′方向复制出互补DNA。

从理论上讲每经过一个循环，样品中的DNA量应该增加1倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的引物、Taq酶等。

DNA体外扩增成功的关键包括两个方面：

一是引物设计合理，二是一个良好的反应体系。

PCR进行到一定次数后产物的积累由指数方式向线性方式变化或反应根本停止成为PCR的平台效应。

成功的PCR有如下特点：

特异性（高度特异性产生一个扩增条带）；有效性（高效率，较少的循环获得较多的特异性产物）；忠实性（体现在由DNA聚合酶诱导的错配率非常低）。

PCR反应的灵敏度高，极易产生假阳性结果，污染来源只要是样品污染即样品间的交叉污染、产物污染和其它污染、环境污染和实验使用的器材试剂等，因此每次反应都应设立阳性和阴性