谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定.docx

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谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

一、[实验目的]

1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；

2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；

3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；

4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。

二、[仪器与试剂]

1．实验材料

动物肝脏

2．实验试剂

（1）0.9%NaCl溶液

（2）海砂

（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）

（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）

（5）0.1%KHCO3溶液

（6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）

（7）2%乙酸溶液

（8）酚的饱和水溶液：

将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。

静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。

新配制的酚展层剂可以反复使用1周。

（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液

（10）0.1%标准谷氨酸溶液

（11）0.1%标准丙氨酸溶液

（12）1%KOH溶液

谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）

一、[实验原理]

观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。

通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。

为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。

二、[实验操作]

1.谷丙转氨酶提取液制备：

2g肝脏+0.9%NaCL6mL+海砂200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。

2.转氨作用

取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL

试剂

对照管

测试管

1%谷氨酸

0.50

1%丙酮酸钠

0.50

0.1%KHCO3

0.50

0.025%一溴乙酸（可不加）

0.25

煮沸的酶液

0.50

—

酶液

—

0.50

加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物

2%乙酸

6滴

沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析

3.纸层析操作方法

取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。

用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。

三、[实验结果]

实验血清谷丙转氨酶活力单位测定

一、[实验原理]

本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。

通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位。

二、[实验试剂]

（1）1/15mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液：

取1/15mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO49.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO49.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。

（2）GPT基质液：

称α-酮戊二酸，29.2mg（2μmol/L）及α-DL-丙氨酸1.78g（200μmol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/LNaOH溶液0.5mL，调pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐，置冰箱中可保存一周。

（3）1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液：

称取2,4-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。

（4）2μmol/mL丙酮酸钠标准液：

精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。

临用前配制。

（5）0.4mol/LNaOH溶液

三、[实验操作]

（一）标准曲线的绘制

试管

试剂

测定管

空白管

2μmol/mL丙酮酸钠标准液

（mL）

—

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

GPT基质液（mL）

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

pH7.4磷酸缓冲液（mL）

0.10

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min

2，4-二硝基苯肼溶液（mL）

0.50

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min

0.4mol/LNaOH（mL）

5.00

充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色

A520nm值

相当丙酮酸含量（μmol）

—

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

相当GPT单位（100mL）

—

100

200

300

400

500

以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。

（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2μmol/mL）。

（2）GPT活力单位为：

每mL血清在37℃与pH=7.4的基质液作用60min，生成1μmol丙酮酸为一个单位（U）。

本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。

（二）酶活力的测定

试管

试剂

对照管

测定管

GPT基质液（mL）

0.50

37℃水浴，预温10min

血清（mL）

—

0.10

PH=7.4磷酸缓冲液（mL）

0.10

0.00

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温60min

2，4-二硝基苯肼（mL）

0.50

充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min

0.4mol/LNaOH（mL）

5.00

摇匀后，静置30分钟，520nm波长下比色。

查标准曲线的对应值，可得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数

（三）实验结果

试管

比色杯吸光值

吸光值

纯吸光值

对照管

测定管

查标准曲线得GTP单位

参考数值GTP单位

（四）注意事项

1.所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2，4-二硝基苯肼等均需冷藏；

2.为防止溶血及其他因素对酶活性影响，实验所用器皿应干净、干燥方可使用；

3.丙酮酸钠极易变质，配试剂时应选择外观洁白干燥者，否则应进行重结晶；

4.转氨酶只能用于α-L-Ala，对D-Ala无催化作用。

实验室多用α-L-Ala，是因为便宜，如果采用α-L-Aa，则用量需减半；

5.如活性高于500U/100mL，应将血清稀释一定倍数重新测定，结果应×稀释倍数；

6.为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定pH、保温时间；

7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差。

实验GPT/ALT在临床诊断意义及检测方法原理

一、GPT/ALT在临床诊断中的意义

转氨酶广泛存在于机体的各个组织中，在肝组织中谷丙转氨酶活性较高，在心脏中谷草转氨酶活性较高。

在正常新陈代谢中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。

当组织发生病变时，由于组织细胞肿胀、坏死（或细胞膜破裂），使细胞膜通透性增高，而导致大量的酶释放至血液中，从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。

因此测定其活性，对肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。

二、丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明

1．用途

本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。

2．基本原理

底物L-丙氨酸与α-酮戊二酸在ALT作用下生成丙酮酸，生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成L-乳酸，同时伴随着NADH氧化，引起在波长340nm处吸光度下降，下降速率与血清ALT活力成正比。

L-丙氨酸+α-酮戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸

氨氨酸+NADH+H+→L-乳酸+NAD++H2O

3.试剂盒组成

试剂

成分

含量

溶液A

Tris缓冲液（pH=8.5）

0.1mol

NADH

0.30mmol

LDH

≥5.0KU/L

溶液B

Tris缓冲液（pH=7.0）

0.1mol

L-丙氨酸

1020mmol

α-酮戊二酸

36mmol

三、[实验仪器]

1.具有能在波长340nm处测定生化分析仪

2.30℃、37℃水浴箱

3.定时器

4.准确的加样器

四、[操作方法]

1.二步法

试管

样本管

空白管

样本

0.3mL

—

蒸馏水

—

0.3mL

溶液A

2.0mL

混匀、放设定温度5min

溶液B

1.0mL

混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算ΔA/min。

2.一步法

试管

样本管

空白管

样本

0.3mL

—

蒸馏水

—

0.3mL

工作液

3.0mL

混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算ΔA/min。

工作液制备：

溶液A与溶液B以2:

1混合，组成测定工作液。

工作液在2-8℃避光保存，可稳定3周。

五、[实验结果]

序号

吸光值

ΔA/min

计算公式

计算结果

参考数值

六、[注意事项]

1.本液体试剂按IFCC推荐法为基础设计，采用二步法，可防止胆红素的干扰；

2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变；

3.本试剂线性可达到600U/L（30℃），或1000U/L（37℃），当样本中ALT活力超过600U/L（30℃）或1000U/L（37℃）时，可用生理盐水稀释，即0.1mL血清加0.2mL生理盐水，测定，结果×3；

4.如试剂变混，或以蒸馏水为空白，工作液在340nm处吸光度＜1.0，请勿使用；

5.贮存条件与有效期（试剂在2-8℃,避光保存，有效期为1年；如用一步法，工作液在2-8℃避光保存，可稳定3周）。

实验检测SGPT活性在科学研究中的应用

一、[基本原理]

测定SGPT活性可反映出肝细胞的坏死程度，因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。

很多有毒物质易引起肝损伤，造成肝实质细胞的变性及坏死，例如，四氯化碳（CCl4）等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。

因此建立由CCl4诱发病变的动物模型，然后检测SGPT活性，常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。

二、[应用实例]

红缘层孔菌多糖对CCl4中毒小鼠转氨酶（SGPT）活性的影响。

将体重20-22g小白鼠随机分为三组，每组10只。

第1组为正常对照，第2组为四氯化碳中毒对照组，第3组为给药组。

给药组以150mg/kg体重的剂量，给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液，每日一次，连续给药7天，其余两组灌胃同体积生理盐水。

于末次给药后24h，给药组、四氯化碳中毒对照组均按10mL/kg体重剂量腹腔注射0.1%CCl4豆油溶液，正常对照组注射同体积豆油，16h后，对三组小白鼠摘眼球取血制血清，按King氏法测定谷丙转氨酶活性（100mL血清与与基质液在37℃条件下作用60min，每生成1μmol丙酮酸为1个活性单位）。

结果见下表：

红缘层孔多菌多糖对CCl4中毒小鼠SGPT活性的影响

组别

SGPT（u%）M±SD

P值

正常对照组

205±17

P≥0.05

CCl4中毒组

336±34

给药组

217±13

由表中数据可见，红缘层孔多菌多糖可抑制由四氯化碳损伤肝细胞引起的小鼠血清谷丙转氨酶活性的升高。

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