谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定.docx

1、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、实验目的1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。二、仪器与试剂1实验材料动物肝脏2实验试剂（1）0.9%NaCl溶液（2）海砂（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1%KHCO3溶液 （6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2%乙酸溶液（8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中

2、，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液（10）0.1%标准谷氨酸溶液（11）0.1%标准丙氨酸溶液 （12）1%KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、实验原理观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。二、实验操作1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。2.转氨作用取试管2支

3、，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL试 剂对照管测试管1%谷氨酸0.500.501%丙酮酸钠0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%一溴乙酸（可不加）0.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.50加脱脂棉塞，45水浴，1.5h，时时振荡内容物2%乙酸6滴6滴沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯

4、突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100显色。三、实验结果实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定一、实验原理本实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位。二、实验试剂（1）1

5、/15mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液：取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO412H2O 23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。（2）GPT基质液：称-酮戊二酸，29.2mg（2mol/L）及-DL-丙氨酸1.78g（200mol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL，调pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐，置冰箱中可保存一周。（3）1mmol/

6、L 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。（4）2mol/mL丙酮酸钠标准液：精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。临用前配制。（5）0.4mol/LNaOH溶液三、实验操作（一）标准曲线的绘制试管试剂测定管空白管123452mol/mL丙酮酸钠标准液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼溶液

7、（mL）0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色A520nm值相当丙酮酸含量（mol）0.100.200.300.400.50相当GPT单位（100mL）100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。（1）丙酮酸钠标准液mL数摩尔浓度（2mol/mL）。（2）GPT活力单位为：每mL血清在37与pH=7.4的基质液作用60min，生成1m

8、ol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果1000即可。（二）酶活力的测定 试管试剂对照管测定管01GPT基质液（mL）0.500.5037水浴，预温10min血清（mL）0.10PH=7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.00充分摇匀后，置于37水浴，保温60min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.00摇匀后，静置30分钟，520nm波长下比色。查标准曲线的对应值，可得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数（三）实验结果试 管比色

9、杯吸光值吸光值纯吸光值对照管测定管查标准曲线得GTP单位参考数值GTP单位（四）注意事项1. 所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2，4-二硝基苯肼等均需冷藏；2. 为防止溶血及其他因素对酶活性影响，实验所用器皿应干净、干燥方可使用；3. 丙酮酸钠极易变质，配试剂时应选择外观洁白干燥者，否则应进行重结晶；4 .转氨酶只能用于-L-Ala，对D-Ala无催化作用。实验室多用-L-Ala，是因为便宜，如果采用-L-Aa，则用量需减半；5. 如活性高于500U/100mL，应将血清稀释一定倍数重新测定，结果应稀释倍数；6.为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定pH、保温时间；7.选用固定分光光度计及比色

10、杯减少误差。实验 GPT/ALT在临床诊断意义及检测方法原理一、GPT/ALT在临床诊断中的意义转氨酶广泛存在于机体的各个组织中，在肝组织中谷丙转氨酶活性较高，在心脏中谷草转氨酶活性较高。在正常新陈代谢中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当组织发生病变时，由于组织细胞肿胀、坏死（或细胞膜破裂），使细胞膜通透性增高，而导致大量的酶释放至血液中，从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。因此测定其活性，对肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。二、丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明1用途本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。2基本原理底物L-丙氨酸与-酮戊二酸在

11、ALT作用下生成丙酮酸，生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成L-乳酸，同时伴随着NADH氧化，引起在波长340nm处吸光度下降，下降速率与血清ALT活力成正比。L-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + L-谷氨酸氨氨酸 + NADH + H+L-乳酸 + NAD+ + H2O3.试剂盒组成试 剂成 分含 量溶液ATris缓冲液（pH=8.5）0.1molNADH0.30mmolLDH5.0KU/L溶液BTris缓冲液（pH=7.0）0.1molL-丙氨酸1020mmol-酮戊二酸36mmol三、实验仪器1.具有能在波长340nm处测定生化分析仪2.30、37水浴箱3.定时器4.准确的加样器四、操作

12、方法1.二步法试 管样本管空白管样 本0.3mL蒸馏水0.3mL溶液A2.0mL2.0mL混匀、放设定温度5min溶液B1.0mL1.0mL混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算A/min。2.一步法试 管样本管空白管样 本0.3mL蒸馏水0.3mL工作液3.0mL3.0mL混匀，准确记录时间，放设定温度1min后，在波长340nm处，以蒸馏水校零，连续监测1-2min，计算A/min。工作液制备：溶液A与溶液B以2:1混合，组成测定工作液。工作液在2-8避光保存，可稳定3周。五、实验结果序号1234吸光值A/min计算公式计算结

13、果参考数值六、注意事项1.本液体试剂按IFCC推荐法为基础设计，采用二步法，可防止胆红素的干扰；2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变；3.本试剂线性可达到600 U/L（30），或1000 U/L（37），当样本中ALT活力超过600 U/L（30）或1000 U/L（37）时，可用生理盐水稀释，即0.1mL血清加0.2mL生理盐水，测定，结果3；4.如试剂变混，或以蒸馏水为空白，工作液在340nm处吸光度1.0，请勿使用；5.贮存条件与有效期（试剂在2-8,避光保存，有效期为1年；如用一步法，工作液在2-8避光保存，可稳定3周）。实验 检测SGPT活性在科学研究中的应用一、基本原理测

14、定SGPT活性可反映出肝细胞的坏死程度，因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。很多有毒物质易引起肝损伤，造成肝实质细胞的变性及坏死，例如，四氯化碳（CCl4）等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。因此建立由CCl4诱发病变的动物模型，然后检测SGPT活性，常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。二、应用实例红缘层孔菌多糖对CCl4中毒小鼠转氨酶（SGPT）活性的影响。将体重20-22g小白鼠随机分为三组，每组10只。第1组为正常对照，第2组为四氯化碳中毒对照组，第3组为给药组。给药组以150mg/kg体重的剂量，给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液，每日一次，连续给药7天，其余两组灌胃同体积生理盐水。于末次给药后24h，给药组、四氯化碳中毒对照组均按10mL/kg体重剂量腹腔注射0.1%CCl4豆油溶液，正常对照组注射同体积豆油，16h后，对三组小白鼠摘眼球取血制血清，按King氏法测定谷丙转氨酶活性（100mL血清与与基质液在37条件下作用60min，每生成1mol丙酮酸为1个活性单位）。结果见下表：红缘层孔多菌多糖对CCl4中毒小鼠SGPT活性的影响组 别SGPT（u%）MSDP值正常对照组20517P0.05CCl4中毒组33634给药组21713由表中数据可见，红缘层孔多菌多糖可抑制由四氯化碳损伤肝细胞引起的小鼠血清谷丙转氨酶活性的升高。