Northern杂交试验指导手册.docx
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Northern杂交试验指导手册
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Northern杂交试验指导手册
DIG标记的Northern杂交试验指导
一、RNA提取
方法一、改良异硫氰酸胍提取法
试剂及其配制
异硫氰酸胍变性液：
贮存液－在含484ml水（经DEPC处理）,17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为：
4mol/L异硫氰酸胍
25mol/L柠檬酸钠pH7.0
0.5%（w/v）N-十二烷基肌氨酸（Sarkosyl）
0.1mol/L巯基乙醇（2-ME）
其它溶液：
2mol/L乙酸钠（NaAc）缓冲液（pH4.0）
水饱和酚（pH3.5）
49∶1（v/v）氯仿/异戊醇
100%异丙醇
70%乙醇（用DEPC处理水配制）
DEPC处理后高压灭菌水
试验程序
1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/lNaAc0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
注意事项
RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。
在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。
为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。
内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。
为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。
方法二、改良Krapp提取法
试剂及其配制
RNA抽提掖：
母液：
4mol异硫氰酸胍
20mmolEDTA
20mmolMES
pH7.0
工作液：
取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。
RNA重悬液：
2molLiCl
10mmolNaAc
调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。
试验程序
1．取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。
如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。
2．4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。
3．上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。
4．小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。
5．在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。
6．4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。
检测后分装，置于-70℃条件下保存。
二、RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。
实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。
方法一、紫外吸收检测
试剂：
TE（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA）。
dH2O
试验程序
1．预热紫外分光光度计10～20min.。
2．取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。
3．取4μlRNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。
4．将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。
RNA浓度和纯度分析
浓度计算：
对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。
纯度分析：
纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。
方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测
试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）:
200mmol/LMOPS（pH7.0）
50mmol/LNaAc
10mmol/LEDTA
准确称取41.86gMOPS,6.8gNaAc,3.72gEDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/LdNaOH将调整pH至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。
上样染料：
50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
其它试剂：
甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
甲酰胺（去离子）
将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1小时后用Whatman滤纸过滤。
等分成1ml于-70℃贮存。
溴化乙锭（EB，10mg/ml）
70%乙醇
试验程序
1．将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
2．配制琼脂糖凝胶：
称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。
3．待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
4．样品制备：
取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。
5．上样：
将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。
6．电泳：
盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
RNA样品质量分析：
完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。
其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。
如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。
如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28SrRNA及18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。
三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆
A．载体选择
为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有：
pGEM-3/pGEM-4（2.87kb,SP6/T7）.
pGEM-3Z（2.74kb,T7/SP6）.
PGEM-3Zf（-）（3.2kb,T7/SP6）.
BluescriptM13-（2.96kb,T7/T3）.
按照试验的经济有效原则，本试验选用BluescriptM13-。
B.目的DNA序列与载体连接
从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。
然后按下列程序进行连接。
试剂及其制备
T4DNA连接酶
连接缓冲液（可直接购买或配制），10X缓冲液配方为：
0.5mol/LTris-HClpH7.8
0.1mol/LMgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
ATP5mmol/L（如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入）。
BSA0.25mg/L
PEG（3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3%的PEG可提高平端连接效率）。
无菌蒸馏水（SDW）
试验程序
1．建立以下反应体系（终体积20μl）：
4μl质粒（50μg/μl）
6μl目的DNA（100μg/μl）
2μl10X连接缓冲液
2μlDNA连接酶
6μl无菌蒸馏水
2．反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。
3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。
注意事项
1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。
2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。
3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。
C．感受态细胞制备（CaCl2法）
试剂及其配制
LB培养基（200ml）：
2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2gNaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl20.1mol/L，4℃保存。
E.coli菌株：
JM105或TG1。
试验程序
1．将单菌落菌株接种于5mlLB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。
2．取0.5ml过夜培养的菌液接种于50mlLB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3．将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
4．将沉淀悬浮于预冷的25ml0.1molCaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
5．沉淀重悬于2ml预冷0.1molCaCl2溶液中，菌液直接用于转化。
或加入1.6ml80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。
D.质粒DNA转化
试剂及其配制
LB培养基（同C）。
氨苄青霉素：
用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素（AP）的LB平板：
每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。
在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：
取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。
X–Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）：
贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。
试验程序
1．取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。
2．然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。
3．向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。
4．与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μlIPTG/X-Gal（4μlIPTG和40μlX-Gal）均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。
5．将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37℃下培养过夜。
含有插入片断的菌落为白色。
E.转化质粒的快速检测
试剂及其配制
煮沸缓冲液：
蔗糖8％
TritonX-1001.5%
EDTA（pH8.0）50mmol/L
Tris-HCl（pH8.0）10mmol/L
LB培养基（同C）
氨苄青霉素（AP）（同D）
试验程序
1．选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。
2．将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。
一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。
另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。
3．将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。
4．将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。
5．取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。
6．在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。
如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。
选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2mlTB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。
四、模板DNA的制备
A．质粒DNA的小量提取
试剂及其配制
含AP的LB液体培养基
TE缓冲液：
10mmol/LTris-HCl（pH8.0）
1mmol/LEDTA（pH8.0）
溶液I：
25mmol/LTris-Cl（pH8.0）
10mmol/LEDTA
50mmol/L葡萄糖
高压灭菌15min.后，4℃贮存。
溶液II:
0.2mol/LNaOH
1%SDS（临用前现配制）
溶液III（100ml）：
5mol/L乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
dH2O28.5ml
4℃贮存。
酚∶氯仿（1∶1）
95%和70%乙醇
试验程序
1．在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。
2．取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3．将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。
4．在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。
5．加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
6．加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。
7．用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。
B．质粒DNA的线性化
试剂及其配制
NotI和SalI内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿（1∶1）
3mol/LNaAc（pH5.2）
100%和70%乙醇
DEPC-H2O
试验程序
1．在离心管中依次加入：
质粒DNA10μl（1μg/μl）
10×内切酶缓冲液10μl
dH2O80μl
SalI或NotI2μl（10U/μl）
2．37℃保温反应2小时以上。
3．消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4．将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5．4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。
6．线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。
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五、RNA探针制备（根据theDIGsystemuser'sguide）
A．地高辛标记的体外转录
试剂及其配制（试剂盒提供）：
10×NTP标记混合物：
inTris-HCl（pH7.5）
10mmolATP
10mmolCTP
10mmolGTP
6.5mmolUTP
3.5mmolDIG-UTP
10×转录缓冲液：
400mmolTris-HCl（pH8.0）
60mmolMgCl2
100mmolDTE（dithioerythritol）
20mmol亚精胺
100mmolNaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μlDNaseI（RNase-free）
20unit/μlRnase抑制剂
20unit/μlT7RNA聚合酶和T3RNA聚合酶
4mol/LLiCl
200mmol/LEDTA
DMPC-H2O
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