丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验仅供参考.docx
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丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验仅供参考
第6章丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及稳定性分析
6.1丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及结构鉴定
丹参酮IIA磺酸钠原料在生产和储存过程中都会出现稳定性问题，如酸性增强、含量降低等现象，质量标准中监控其相关物质成为必要，提供高纯度的相关物质对照品成为很大挑战。
随着药品质量标准提高，ICH要求尽可能提供单杂大于0.1%的相关物质结构和可能的产生机制，构效关系和药理毒数据等。
因此我们从丹参酮IIA磺酸钠原料生产过程中的精制母液中分离纯化获得相关物质，并和丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质进行HPLC对照，再通过LC-MS和1H-NMR分析，最终确定其结构。
BaolinWang等从丹参酮IIA磺酸钠原料中通过色谱分离纯化、LC-MSn和NMR鉴定推测出八种相关物质；QiaogenZou等从丹参酮IIA磺酸钠原料中通过色谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出六种相关物质。
而其磺化过程中的副产物和杂质成分研究还不够完善，我们通过制备液相技术分离纯化丹参酮IIA磺酸钠精制母液中的组分，寻找确定丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，分别确证为丹参酮IIB磺酸钠
（2）、丹参酮I磺酸钠（4）\紫丹参甲素磺酸钠（5/6），其中4已作为药典标准中的杂质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），但2和5/6尚未见有文献报道得到纯物质。
[1,2]
6.1.1仪器与原料
VarianSD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱L&L4001,1inch.×25cm，色谱柱4002,2inch,×25cm；孔径12nm粒径5μm色谱填料ODS-AQ100g，理论工作压力1500psi，YMC;孔径12nm粒径10μm色谱填料PLRP-S150g，理论工作压力650psi，AngilentTechnologies；Waters2695/2489高效液相色谱仪；色谱柱AngilentExtendC185μm，4.6×15cm；400M核磁共振波谱仪，NMRAvanceIII400MHz，瑞士公司；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪，ACQUITYTIMUPLC&Q-TOFMSPremier，USAWaters公司。
丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液（自制）；纯化水；甲醇，HPLC,Tedia、FisherScientific和Merk；三乙胺（TEA）,HPLC,Tedia。
6.1.2方法
6.1.2.1样品前处理
丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液进行相关物质富集前先在37℃条件下减压旋蒸结晶后滤纸过滤在经过0.22μm有机相微孔滤膜做过滤除菌处理。
6.1.2.2富集和进一步纯化
选用装填PLRP-S聚合物填料的VarianL&L4002色谱柱。
实验体系为甲醇/水，20%～80%梯度洗脱，流速为100mL/min，检测波长为271nm。
根据紫外检测结果实时收集样品。
6.1.2.3二步纯化及精制
选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianL&L4002色谱柱。
实验体系为0.1%TEA-甲醇/0.1%TEA-水，20%～60%梯度洗脱，流速为25mL/min，检测波长为271nm。
根据紫外检测结果实时收集样品。
6.1.2.4HPLC检测
在富集、纯化精制过程中采用HPLC方法对样品组成及含量进行全程监测。
HPLC监测体系为：
AgilentExtendC18，5μm，4.6*150mm,流速为1mL/min，检测波长为271nm。
6.1.2.5冻干
经HPLC检测纯度>98%的样品进行冻干保存。
6.1.2.6结构鉴定
将完成冻干的样品，进行LC-MS和1H-NMR检测。
6.1.3结果与讨论
6.1.3.1丹参酮IIA磺酸钠原料与精致母液的相关物质组成
图1丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测图谱
丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测结果见图1。
根据图中结果显示，丹参酮IIA磺酸钠原料中含有5%左右的总杂含量，主要包含了六中相关物质（编号1,2,3,4,5,6），其保留时间分别为13.122min，13.474min，15.576min，17.139min，19.196min及19.433min。
其中，4为已确认的丹参酮I磺酸钠，并作为药典标准中的相关物质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），而其余相关物质药典中尚未提供相对关照品。
为简化相关物质的富集工作，采取从车间精制母液中富集提取相关物质的方法。
丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测结果见图2。
图中结果显示，精制母液中含有保留时间为13.495min（a）和19.122（b）的相关物质，其含量分别为15.6%和32.6%，远高于原料中相关物质含量。
图2丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测图谱
6.1.3.2相关物质的富集与一步纯化
根据图3结果显示，利用L&L4002柱进行一次富集后，可获得HPLC纯度达到40%～50%的相关物质样品。
图3富集后相关物质a（3.3-1）和b（3.3-2）的HPLC检测图
一步纯化体系同富集体系，梯度洗脱20%～60%。
根据图4结果显示，经过一步纯化后，相关物质a、b纯度已达到80%。
图4一步纯化后相关物质a（3.4-1）和b（3.4-2）的HPLC检测图
6.1.3.3二部纯化及精制
相关物质的二步纯化及精制过程选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianL&L4001色谱柱。
实验体系为0.1%TEA-水。
根据图5的结果可见，经过二步纯化和精制两步骤，获得纯度>98%的a和b。
样品加入丹参酮IIA磺酸钠原料，根据HPLC结果推出a可能为相关物质2，b可能为相关物质5和6。
图5二步纯化和精制后相关物质a（3.5-1）和b（3.5-2）的HPLC检测图
6.1.3.4结构鉴定与解析
相关物质2为无定形红棕色粉末，如图6所示，LC-MS测得其分子离子峰C19H17O7S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为389.0.1H-NMR（D2O,400MHz，ppm）数据（见图7）显示，两个甲基氢化学位移信号H7.530（1H，J=8.0HZ，d，H-6）和H7.181（1H，J=8.0HZ，d，H-7）；三个亚甲基氢化学位移信号2.680-2.730（2H，m，H-1），H1.401-1.083（2H，m，H-19），化学位移受离子对试剂TEA残留干扰，最终确定其结构如图8所示，为丹参酮B磺酸钠。
图6丹参酮IIA磺酸钠相关物质2LC-MS数据
图7丹参酮IIA磺酸钠相关物质21H-NMR数据
相关物质4为无定形褐色粉末，其在HPLC检测体系中保留时间为17.1min。
MS测得其分子离子峰C18H11O6S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为355.0265，根据1H-NMR（D3COD,400MHz，ppm）数据显示，两个甲基氢化学位移信号H2.49（3H，s，H-19），五个苯氢化学位移信号H9.260（1H，J=8.8Hz，d，H-1），H7.532-7.572（1H，m，H-2），H7.406（1H，J=6.8Hz，d，H-3）,H8.478（1H,J=8.8Hz，d，H-6），H8.004（1H，J=8.8Hz，d，H-7）。
相关物质4目前尚在研究中，推测其为丹参酮磺酸钠，结构结构如图8所示。
相关物质5/6为无定形红棕色粉末，LC-MS测得其分子离子峰C19H17O7S（[M-Na]-）质荷比（m/z）为389.0,1H-NMR（D20,400MHz，ppm）数据显示，两个苯氢化学位移信号H4.789（2H，m，H-2）和H1.530-1.635（2H，m，H-3）；-CH2OH氢化学位移信号H4.789（2H，s，H-17），化学位移受离子对试剂TEA残留干扰。
目前推测其为紫丹参甲素磺酸钠，结构结构如图8所示。
图8推测丹参酮IIA磺酸钠相关物质化学结构
表1丹参酮IIA磺酸钠相关物质HPLC检测及MS数据
相关物质
tR（min）
[M-Na]-（m/z）
化学结构
2
13.19
389
丹参酮IIB磺酸钠
4
17.02
355
丹参酮I磺酸钠（推测）
5/6
19.14
389
紫丹参甲素磺酸钠（推测）
丹参酮IIA磺酸钠
21.2
373
丹参酮IIA磺酸钠
综上，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，其中相关物质2确证为丹参酮B磺酸钠（SodiumTanshinoneIIBSulfonate），相关物质4和相关物质5/6还有待进一步研究确认，目前推测其分别为丹参酮磺酸钠（SodiumTanshinoneISulfonate，4）和紫丹参甲素磺酸钠（SodiumTanshinoneISulfonate，5/6）。
其中2的标准纯物质尚未被报道过，见表1。
丹参酮IIA磺酸钠相关物质产生主要来源于丹参酮A原料中丹参组织来源的丹参酮A结构类似物引入合成工艺中磺化反应过程，产生副反应产物，在精制过程重结晶时的共结晶沉淀，以及丹参酮IIA磺酸钠原料制备和保存过程中的降解反应等。
相关物质4、5/6目前限于LC上难以区分，其准确定位有待进一步研究。
6.2丹参酮IIA磺酸钠稳定性分析
丹参酮IIA磺酸钠是从中药丹参中提取丹参酮IIA，经磺化后得到的水溶性钠盐。
由于用来制备丹参酮IIA磺酸钠的原料丹参酮IIA，是经过药材提取纯化所得，因此不可避免的含有其它丹参酮类化合物，同时，磺化过程中也会产生很多副产物，反应产物经过结晶后，除去了其中大部分的杂质，但仍有微量杂质存在。
而目前，丹参酮IIA磺酸钠研究主要还是集中在其药理活性的探讨上，原料药中的微量杂质成分的研究还是空白。
基于此方面的考虑，我们准备进行初步的研究。
国家标准记载丹参酮IIA磺酸钠（见国家药品标准WS-10001-（HD-0923）-2002）的性状为：
本品为砖红色结晶性粉末；无臭，味微苦；有吸湿性；遇高热，见光色渐变深。
在热水中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在氯仿中不溶。
从上面的叙述中我们可以知道，丹参酮IIA磺酸钠对光和热不稳定，不利于长时间加热和光照，且具有吸湿性。
稳定性试验的目的是考察原料在温度，湿度，光线的影响下随时间变化的规律。
根据丹参酮IIA的特点和我公司的实际情况，我们将温度作为重点考察因素作一系列的试验。
样品选择：
抽取6批丹参酮IIA磺酸钠作为供试品，批号分别为：
1207154，1207156，1208168，1208170，1208171，1208174。
储存条件：
以上每批样品分为5份，分别放置于0-10℃，室温，30℃，40℃，50℃环境中保存，定期抽样检测。
抽样频率：
试验起始之日起，每月取样一次，持续半年，共计7次。
检测项目：
含量测定和相关物质检测。
丹参酮IIA磺酸钠稳定性数据见表6.1。
为了更清晰直观的进行观察分析，将试验数据转化为图表形式表现，见图6.2。
根据图6.2结果显示，环境温度越高，丹参酮IIA磺酸钠的杂质含量也越高。
在高温环境中（30度、40度、50度），杂质含量随着储存时间增长而增大。
而在0-10度环境和常温下，杂质含量趋于平稳。
由此可以证明，丹参酮IIA磺酸钠对高温不稳定。
[1]BaolinWangetal.IsolationandstructurecharacterizationofrelatedimpuritiesinSodiumTanshinoneIIASulfonatebyLC/ESI-MSnandNMR.Journal
OfPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.2012,67（68）:
36-41.
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