医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版.docx
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医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版
医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究
王继东1周丽珍1宫玲玲1唐丽凤1郁敏1糜祖煌3
1．江南大学附属医院（无锡市第五人民医院）214073
2．无锡市克隆遗传技术研究所214026
铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa,Pa）是呼吸道最常见的条件致病菌，也是医院感染的常见病原菌。
其耐药多由于产生灭活药物的酶和/或细菌外膜对药物的通透性降低使抗菌素失效[1]。
近年来Pa菌多重耐药株引起的感染常使临床治疗面临诸多困难，国外的分子生物学研究发现，Pa菌可以通过获得各种β内酰胺酶编码基因（广谱或超广谱β内酰胺酶、金属β内酰胺酶等）和／或外膜通道蛋白OprD2基因缺失而导致对β内酰胺类抗生素耐药的重要原因[2-5],由于β内酰胺类抗生素的广泛使用和碳青霉烯酶的产生，使其耐药性明显上升[6]。
Pa菌还可通过获得氨基糖苷类修饰酶钝化氨基糖苷类抗生素而耐药[7]，Pa菌并可以借助获得整合子qacE△1基因从而耐消毒剂[8]。
耐消毒剂Pa菌株的出现大大提高了引起医院内感染的可能性。
为了解我院Pa菌医院感染分离株中β内酰胺酶、oprD2、氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况和铜绿假单胞菌的多重耐药机制，我们对37株Pa菌进行了TEM、SHV、CTX-M、OXA-10group、PER、GES、VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、和oprD2等12种β内酰胺类抗菌药物耐药相关基因和aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰ、aac（6′）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ等5种氨基糖苷类修饰酶基因以及耐消毒剂基因（qacE△1-sul1）的检测研究，现报告如下。
1材料与方法
1.1菌株来源37株Pa菌均分离本院2004年1月～2005年12月住院病人临床标本。
其中痰液29份，气管切开患者气管内分泌物4份，胸水2份，伤口分泌物1份,眼部分泌物1份。
用法国生物－梅里埃公司VITEK--32系统鉴定菌种。
标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.2药敏试验采用K-B法测定15种抗菌药物的敏感性。
并根据美国临床实验室标准化委员会（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards，NCCLS）2004年版要求进行抗生素敏感性判断。
1.3细菌处理挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内（内已预置200ng/ml蛋白酶K溶液）。
56℃水浴2h，改95℃水浴10min。
离心15000r/min30s，移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液置入-20℃冰箱备用。
1.4基因检测 均为PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。
各种靶基因PCR扩增体系均为：
每反应体系P1、P2引物各0.5μM,KCl10mM,（NH4）2SO48mM，MgCl22mM，Tris-HCl（pH9.0）10mM，NP400.5%，BSA0.02%（wt/vol），TaqDNApol1U。
总反应体积20μl（其中模板液5μl）。
热循环参数（>500bp）PCR为：
93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min,其余均为：
93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。
产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。
耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
表1:
耐药基因PCR引物序列
基因名称
引物序列（5′→3′）
产物长度
TEM
P1:
AGGAAGAGTATGATTCAACA
535bp
P2:
CTCGTCGTTTGGTATGGC
SHV
P1:
GGCTATGCGTTATATTCGCC
867bp
P2:
GGTTAGCGTTGCCAGTGC
CTX-M
P1:
ATGGTTAAAAAATCACTGCGC
833bp
P2:
TCCCGACGGCTTTCCGCCTT
OXA-10group
P1:
GTCTTTC（A/G）AGTACGGCATTA
822bp
P2:
GATTTTCTTAGCGGCAACTTA
PER
P1:
AGTCAGCGGCTTAGATA
978bp
P2:
CGTATGAAAAGGACAATC
GES
P1:
ATGCGCTTCATTCACGCAC
846bp
P2:
CTATTTGTCCGTGCTCAGG
VEB
P1:
GCGGTAATTTAACCAGA
961bp
P2:
GCCTATGAGCCAGTGTT
CARB
P1:
AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC
588bp
P2:
TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC
DHA
P1:
AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT
405bp
P2:
CCGTACGCATACTGGCTTTGC
IMP
P1:
CGGCC（G/T）CAGGAG（A/C）G（G/T）CTTT
587bp
P2:
AACCAGTTTTGC（C/T）TTAC（C/T）AT
VIM
P1:
ATTCCGGTCGG（A/G）GAGGTCCG
633bp
P2:
GAGCAAGTCTAGACCGCCCG
OprD2
P1:
GCGCATCTCCAAGACCATG
193bp
P2:
GCCACGCGATTTGACGGAG
aac（3）-Ⅱ
P1:
ACTGTGATGGGATACGCGTC
237bp
P2:
CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA
aac（6′）-Ⅰ
P1:
TATGAGTGGCTAAATCGA
394bp
P2:
CCCGCTTTCTCGTAGCA
aac（6′）-Ⅱ
P1:
TTCATGTCCGCGAGCACCCC
178bp
P2:
GACTCTTCCGCCATCGCTCT
ant（3″）-Ⅰ
P1:
TGATTTGCTGGTTACGGTGAC
284bp
P2:
CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG
ant（2″）-Ⅰ
P1:
GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG
320bp
P2:
CTGTTACAACGGACTGGCCGC
qacE△1-sul1
P1:
TAGCGAGGGCTTTACTAAGC
300bp
P2:
ATTCAGAATGCCGAACACCG
1.5耐药基因亲缘性分析以耐药基因为分子标记作检测结果的聚类分析
2结 果
2.1抗生素敏感性试验结果 见表2。
表2：
37株Pa菌对15种抗菌药物的敏感性
抗菌药物
敏感株数（%）
中敏株数（%）
耐药株数（%）
庆大霉素
16（43.24）
3（8.11）
16（43.24）
头孢匹美
25（67.57）
0
10（27.03）
头孢曲松
5（13.51）
3（8.11）
27（72.97）
头孢他啶
18（48.65）
1（2.70）
16（43.24）
头孢唑啉
0
0
37（100）
妥布霉素
17（45.95）
1（2.70）
17（45.95）
亚胺培南
21（56.76）
2（5.41）
12（32.43）
左旋氧氟沙星
18（48.65）
0
17（45.95）
氨苄西林
0
1（2.70）
34（91.89）
氨苄西林/舒巴坦
2（5.41）
0
33（89.19）
氨曲南
12（32.43）
1（2.70）
22（59.46）
呋喃妥因
1（2.70）
0
34（91.89）
复方新诺明
0
0
37（100）
环丙沙星
16（43.24）
1（2.70）
18（48.65）
哌拉西林／他唑巴坦
16（43.24）
0
19（51.35）
2.2 β内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检测结果 37株Pa菌中发现阳性TEM9株（24.32%）、CARB16株（43.24%）、VIM2株（5.4%）、oprD2基因均缺失32株（86.49%），其余基因均为阴性。
第6号、12号菌株TEM、CARB和VIM基因PCR产物经DNA测序和BLAST比对（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）分别为TEM-1型+CARB-like型+VIM-2型和TEM-1型+CARB-3型。
其中CARBlike型（与CARB-4型基因序列[注册号：
U14749]高度同源,一致率99.4%。
但与已注册CARB各型存在有义突变,本文以CARBlike命名）。
本研究中CARBlike型、VIM-2型基因序列已成功注册GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide,注册号：
DQ309772、DQ077823）。
国内4家医院铜绿假单胞菌β内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检出情况比较见表3。
图1为TEM基因PCR产物电泳图，图2为CARB基因PCR产物电泳图，图3为VIM-2型，图4为6号株TEM、CARB、VIM基因PCR产物测序图。
表3国内四家医院铜绿假单胞菌β内酰胺类抗菌药物耐药基因检出情况
基因
江大附院
湖州98医院[9]
襄樊中心医院[2]
花都医院[10]
TEM
9（24.32%）
20（71.43%）
18（51.42%）
18（55.56%）
CARB
17（45.95%）
未检测
未检测
未检测
VIM
2（5.41%）
0
0
0
OXA
0
1（3.57%）
6（17.14%）
0
DHA
0
0
1（2.86%）
5（27.78%）
IMP
0
0
0
4（22.22%）
OprD2缺失
32（86.49%）
25（89.29%）
35（100%）
3（16.67%）
图1TEM基因PCR电泳图
［M:
分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
阳性对照,N:
阴性对照,S:
标本阳性］
图2CARB基因PCR电泳图
［M:
分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
阳性对照,N:
阴性对照,S:
标本阳性］
图3VIM-2基因PCR电泳图
［M:
分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
阳性对照,N:
阴性对照,S:
标本阳性］
图4-1TEM基因测序图
图4-2CARB基因测序图
图4-3VIM基因测序图
2.3氨基糖苷类修饰酶基因检测结果37株Pa菌中阳性株为：
aac（6′）-Ⅰ3株（8.11%）、aac（6′）-Ⅱ16株（43.24%）、ant（3″）-Ⅰ7株（18.91%）、ant（2″）-Ⅰ15株（40.54%）其余基因均为阴性。
图5为aac（6′）-Ⅰ基因PCR产物电泳图,图6为ant（2″）-Ⅰ基因PCR产物电泳图。
图5aac（6’）-Ⅰ基因PCR电泳图
［M:
分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
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