医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版.docx

1、医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究王继东1 周丽珍1 宫玲玲1 唐丽凤1 郁敏1 糜祖煌31江南大学附属医院（无锡市第五人民医院）2140732无锡市克隆遗传技术研究所 214026铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa, Pa）是呼吸道最常见的条件致病菌，也是医院感染的常见病原菌。其耐药多由于产生灭活药物的酶和/或细菌外膜对药物的通透性降低使抗菌素失效1。近年来Pa菌多重耐药株引起的感染常使临床治疗面临诸多困难，国外的分子生物学研究发现，Pa菌可以通过获得各种内酰胺酶编码基因（广谱或超广谱内酰胺酶、金属内酰胺酶

2、等）和或外膜通道蛋白OprD2基因缺失而导致对内酰胺类抗生素耐药的重要原因2-5,由于内酰胺类抗生素的广泛使用和碳青霉烯酶的产生，使其耐药性明显上升6。Pa菌还可通过获得氨基糖苷类修饰酶钝化氨基糖苷类抗生素而耐药7，Pa菌并可以借助获得整合子qacE1基因从而耐消毒剂8。耐消毒剂Pa菌株的出现大大提高了引起医院内感染的可能性。为了解我院Pa菌医院感染分离株中内酰胺酶、oprD2、氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况和铜绿假单胞菌的多重耐药机制，我们对37株Pa菌进行了TEM、SHV、CTX-M、OXA-10group、PER、GES、VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、和oprD2等12种内

3、酰胺类抗菌药物耐药相关基因和aac（3）-、aac（6）-、aac（6）-、ant（3）-、ant（2）-等5种氨基糖苷类修饰酶基因以及耐消毒剂基因(qacE1-sul1)的检测研究，现报告如下。1 材料与方法1.1 菌株来源 37株Pa菌均分离本院2004年1月2005年12月住院病人临床标本。其中痰液29份，气管切开患者气管内分泌物4份，胸水2份，伤口分泌物1份,眼部分泌物1份。用法国生物梅里埃公司VITEK-32系统鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。1.2 药敏试验 采用K-B法测定15种抗菌药物的敏感性。并根据美国临床实验室标准化委员会（

4、National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）2004年版要求进行抗生素敏感性判断。1.3 细菌处理 挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内（内已预置200ng/ml蛋白酶K溶液）。56水浴2h，改95水浴10min。离心15000r/min30s，移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液置入-20冰箱备用。1.4 基因检测均为PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5M,KCl 10mM,（NH4）2SO4 8mM，MgCl2 2mM，Tri

5、s-HCl（pH9.0） 10mM，NP40 0.5%，BSA 0.02%（wt/vol），Taq DNA pol 1U。总反应体积20l（其中模板液5l）。热循环参数(500bp)PCR为：93预变性2min，然后9360s5560s7260s，循环35周期，最后一个72延长至5min,其余均为：93预变性2min，然后9330s5530s7260s，循环35周期，最后一个72延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。表1: 耐药基因PCR引物序列基因名称引物序列（

6、53）产物长度TEMP1:AGGAAGAGTATGATTCAACA535bpP2:CTCGTCGTTTGGTATGGCSHVP1:GGCTATGCGTTATATTCGCC867bpP2:GGTTAGCGTTGCCAGTGCCTX-MP1:ATGGTTAAAAAATCACTGCGC833bpP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTTOXA-10groupP1:GTCTTTC(A/G)AGTACGGCATTA822bpP2:GATTTTCTTAGCGGCAACTTAPERP1:AGTCAGCGGCTTAGATA978bpP2:CGTATGAAAAGGACAATCGESP1:ATGCGCTTCA

7、TTCACGCAC846bpP2:CTATTTGTCCGTGCTCAGGVEBP1:GCGGTAATTTAACCAGA961bpP2:GCCTATGAGCCAGTGTTCARBP1:AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC588bpP2:TCAGCGCGACTGTGATGTATAAACDHAP1:AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT405bpP2:CCGTACGCATACTGGCTTTGCIMPP1:CGGCC(G/T)CAGGAG(A/C)G(G/T)CTTT587bpP2:AACCAGTTTTGC(C/T)TTAC(C/T)ATVIMP1:ATTCCGGTCGG(A/G)GA

8、GGTCCG633bpP2:GAGCAAGTCTAGACCGCCCGOprD2P1:GCGCATCTCCAAGACCATG193bpP2:GCCACGCGATTTGACGGAGaac(3)-P1:ACTGTGATGGGATACGCGTC237bpP2:CTCCGTCAGCGTTTCAGCTAaac(6)-P1:TATGAGTGGCTAAATCGA394bpP2:CCCGCTTTCTCGTAGCAaac(6)-P1: TTCATGTCCGCGAGCACCCC178bpP2:GACTCTTCCGCCATCGCTCTant(3)-P1:TGATTTGCTGGTTACGGTGAC284bpP2:CGC

9、TATGTTCTCTTGCTTTTGant(2)-P1:GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG320bpP2:CTGTTACAACGGACTGGCCGCqacE1- sul1P1:TAGCGAGGGCTTTACTAAGC300bpP2:ATTCAGAATGCCGAACACCG1.5耐药基因亲缘性分析 以耐药基因为分子标记作检测结果的聚类分析 2 结果2.1 抗生素敏感性试验结果见表2。表2： 37株Pa菌对15种抗菌药物的敏感性抗菌药物敏感株数（%）中敏株数（%）耐药株数（%）庆大霉素16（43.24）3（8.11）16（43.24）头孢匹美25（67.57）010（27.03）头孢曲松5

10、（13.51）3（8.11）27（72.97）头孢他啶18（48.65）1（2.70）16（43.24）头孢唑啉0037（100）妥布霉素17（45.95）1（2.70）17（45.95）亚胺培南21（56.76）2（5.41）12（32.43）左旋氧氟沙星18（48.65）017（45.95）氨苄西林01（2.70）34（91.89）氨苄西林/舒巴坦2（5.41）033（89.19）氨曲南12（32.43）1（2.70）22（59.46）呋喃妥因1（2.70）034（91.89）复方新诺明0037（100）环丙沙星16（43.24）1（2.70）18（48.65）哌拉西林他唑巴坦16（43.

11、24）019（51.35）2.2内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检测结果37株Pa菌中发现阳性TEM 9株(24.32%)、CARB16株 (43.24%)、VIM2株（5.4%）、oprD2基因均缺失32株(86.49%)，其余基因均为阴性。第6号、12号菌株TEM、CARB和VIM基因 PCR产物经DNA测序和BLAST比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分别为TEM-1型+CARB-like型+VIM-2型和TEM-1型+CARB-3型。其中CARB like型(与CARB-4型基因序列注册号：U14749高度同源,一致率99.4%。但与已注册CARB各型存在有义突变

12、,本文以CARB like命名)。本研究中CARB like型、VIM-2型基因序列已成功注册GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide,注册号：DQ309772、DQ077823)。国内4家医院铜绿假单胞菌内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检出情况比较见表3。图1为TEM基因 PCR产物电泳图，图2为CARB基因 PCR产物电泳图，图3为VIM-2型，图4为6号株TEM、CARB、VIM基因 PCR产物测序图。表3 国内四家医院铜绿假单胞菌内酰胺类抗菌药物耐药基因检出情况基 因江大附院湖州98医院9襄樊中心医院2花都医院10TEM9（24.32%）20（71.4

13、3%）18（51.42%）18（55.56%）CARB17（45.95%）未检测未检测未检测VIM2（5.41%）000OXA01（3.57%）6（17.14%）0DHA001（2.86%）5（27.78%）IMP0004（22.22%）OprD2缺失32（86.49%）25（89.29%）35（100%）3（16.67%）图 1 TEM基因PCR电泳图M:分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P: 阳性对照,N: 阴性对照,S:标本阳性图2 CARB基因PCR电泳图M:分子标记,由上而下分别为100

14、0、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P: 阳性对照,N: 阴性对照,S:标本阳性图3 VIM-2基因PCR电泳图M:分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P: 阳性对照,N: 阴性对照,S:标本阳性图4-1 TEM基因测序图图4-2 CARB基因测序图图4-3 VIM基因测序图2.3氨基糖苷类修饰酶基因检测结果 37株Pa菌中阳性株为：aac（6）-3株(8.11%)、aac(6)-16株（43.24%）、ant(3)-7株（18.91%）、ant(2)-15株（40.54%）其余基因均为阴性。图5为aac（6）-基因 PCR产物电泳图,图6为ant（2）-基因 PCR产物电泳图。图5 aac(6)-基因PCR电泳图M:分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P: