微 生 物 实 验 教 案.docx

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微生物实验教案

微生物实验教案

第一部分基础性实验

实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

一、实验目的

以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。

二、显微镜油镜使用的原理

1普通光学显微镜的基本构造

（1）光学部分:

接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。

它使检视物放大,造成物象。

（2）机械部分:

镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。

它起着支持、调节、固定等作用。

2显微镜的放大倍数和分辨率

（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

（2）显微镜的分辨率：

表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：

D=λ/2n·sin（α/2）

式中D：

物镜分辨出物体两点间的最短距离。

λ：

可见光的波长（平均0.55μm）

n:

物镜和被检标本间介质的折射率。

：

镜口角（即入射角）。

3油镜使用的原理

油镜，即油浸接物镜。

当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。

若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

三、实验材料

1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。

2细菌三种形态的玻片染色标本。

3培养12-18h的枯草芽孢杆菌。

四、实验方法与步骤

1染色细菌玻片的油镜观查

（1）用前检查：

零件是否齐全，镜头是否清洁。

（2）调节光亮度。

（3）低倍镜观察：

先粗调再微调至物象清晰。

（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。

（5）油镜观察：

高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

（6）绘出所观察到的细菌形态图像。

（7）、换片：

另换新片观察，必须从（3）步开始操作。

（8）、用后复原：

观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

2、活菌制片观察

取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。

五、实验报告

油镜使用的原理

六、思考题

1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？

应特别注意些什么？

2使用油镜时，为什么必须用镜头油？

3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

七、实验注意事项

1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。

2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。

3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。

当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

4观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。

5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。

6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

实验二细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。

2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验原理

1简单染色的原理

大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。

染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

2革兰氏染色的原理

革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

三、实验材料

1大肠杆菌24h的斜面培养物。

2葡萄球菌24h的斜面培养物。

3简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）

4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）

5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

四、实验方法和步骤

附表1细菌染色法分类

附表2微生物染色常用染料

A酸性染料：

如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。

B碱性染料：

一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。

C中性（复合）染料：

如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。

D单纯染色：

这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb）的染料

1、简单染色

（1）涂片:

取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。

注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

（2）干燥：

自然气干或酒精灯高处微微加热。

（3）固定:

于火焰上通过2—3次。

（4）染色：

在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。

（5）水洗：

倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。

（6）干燥：

空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。

（7）镜检：

在油镜下观察细菌形态。

2革兰氏染色

（1）涂片。

（2）初染：

在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

（3）媒染：

先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

（4）脱色：

除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。

（5）复染：

滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。

（6）镜检：

观察染色结果。

五、实验报告

1革兰氏染色的基本原理和意义

2革兰氏染色成败的关键

六、思考题

1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？

2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？

3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？

其染色成败的关键一步是什么？

4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?

实验三细菌的鞭毛染色及其运动观察

一、实验目的

1学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。

2用压滴法观察细菌的运动

3用悬滴法观察细菌的运动

二、实验原理

鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。

鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。

三、实验材料

1菌种：

普通变形杆菌斜面菌种

2鞭毛染色液：

A液，B液。

30.01％的美蓝水溶液、无菌水，凹玻片、载玻片，盖玻片、香柏油、镊子、酒精灯、擦镜纸、二甲苯、吸水纸等。

四、实验方法

（一）细菌鞭毛染色

1制片：

在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，在载玻片的水滴中轻沾几下。

将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。

2染色：

涂片干燥后滴加A液染3-5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：

一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。

洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30-60秒钟。

然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。

3镜检：

镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。

菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

注意点：

染色成功的关键主要决定于：

（a）菌种活化的情况，即要连续移种几次；（b）菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；（c）新鲜的染色液。

（d）制片时不能加热固定

（二）细菌运动的观察

1压滴法

（1）制备菌液：

从幼龄普通变形菌斜面上，挑数环菌放入装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

（2）取2-3环稀释菌液于洁净载玻片个央，再加入一环0.01％的美蓝水溶液，混匀。

（3）用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。

（4）镜检：

将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。

要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。

2悬滴法

（1）取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。

（2）在盖玻片中央滴一小滴菌液

（3）将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起（注意液滴不得与凹玻片接触）。

（4）小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。

再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。

（5）镜检：

将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。

五、实验结果和报告

1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。

2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？

六、思考题

1制片时为什么不能加热固定？

2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？

真实地记录你观察到的现象，并进行解释。

3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?

4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?

如何控制?

5试设计—实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。

实验四细菌的芽孢、荚膜染色

一、实验目的

1掌握细菌的芽孢染色法。

2掌握细菌的荚膜染色法。

二、实验材料

1枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。

2二甲苯、香柏油、蒸馏水、5％孔雀绿水溶液、0.5％沙黄水溶液（或0.05％碱性复红）、绘图墨水（用滤纸过滤后备用）、95％乙醇、石炭酸复红染液。

3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管（1x6.5cm）、烧杯（300mL）、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。

三、实验方法和步骤

（一）芽孢染色法

1方法1

（1）取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。

（2）于载片上滴入3-5滴5％孔雀绿水溶液。

（3）用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。

加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

（4）倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

（5）用0．5％沙黄水溶液（或0.05％碱性复红）复染1min，水洗。

（6）制片干燥后用油镜观察。

芽孢呈绿色，菌体红色。

2方法2

（1）加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。

（2）加5％孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

（3）将此试管浸于沸水浴（烧杯）中，加热15-20min。

（4）用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。

（5）水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

（6）加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直