谷物中赖氨酸的含量讲课教案.docx
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谷物中赖氨酸的含量讲课教案
谷物中赖氨酸的含量
1引言
1.1国外研究概况
赖氨酸的研究始于国外，1889年德莱赛尔首先用酸水解法从酪蛋白水解物中分离出赖氨酸和精氨酸混合物。
1891年弗雪及德莱赛尔分别从上述混合物中分离到纯的赖氨酸。
1902年弗雪与韦特用合成法制成赖氨酸并确定了赖氨酸的化学结构。
1957年加拿大理查德等人从600株霉菌中筛选得到两株黑粉菌，这两株黑粉菌能发酵生成0.2～0.3g/l赖氨酸；同时都伦纳用同一菌进行培养研究，使赖氨酸生成量提高至0.7～0.8g/l；其后,汉斯肯又将生成量提高1.95g/l，这是最早有关发酵法生成赖氨酸的研究。
虽然赖氨酸被发现的很早，但是赖氨酸的工业生产却是在半个多世纪以后，1958年日本的木下祝郎、中山清等采用紫外线照射谷氨酸棒杆菌得到了一株高丝氨酸（或苏氨酸＋蛋氨酸）的营养缺型变异株，使赖氨酸生成量达到工业生产水平。
既然赖氨酸被应用到工业生产中那么就不得不面临一个问题：
即怎样测定一种物质中是否含有赖氨酸，含有多少，是否值得工业生产。
那么赖氨酸含量的测定作为一个新课题开始被科学家们所重视。
如：
Sanger（1945）首倡，Roach等（1976）改进的氟二硝基甲苯法（FDNB），该法的主要误差来源于待测样中碳水化合物的干扰，对热处理的影响也不够敏感，所以只适用于专门的对比试验参考。
由Carpenter和Roach（1967）首倡，Kakade和Liener（1969）改进的三硝基苯磺酸（TNBS）试剂测定有效赖氨酸的分析程序，此后十年间此法被多次提到并应用，该法利用蛋白质中的赖氨酸残基的ε氨基与TNBS的磺酸基发生特异性不可逆取代反应，形成三硝基苯（TNP）复合物，在367nm和420nm波长处有特征光吸收，以此测定蛋白中自由氨基含量，但是,此法操作很复杂,要求条件较高。
随后Tsai（1972）提出了2-氯-3，5-二硝基吡啶（CDNP）法测定赖氨酸含量，比之前的方法简便一些但还是很复杂。
直到Hurrell（19761978）提出染料结合法（DBL）法测定谷物中有效赖氨酸，此法不需要复杂的水解过程，测定时间也比之前的几种方法短很多。
在此之后科学家们又提出了2，4，6-三硝基苯-1-磺酸法，此法是TNBS法的改进法，此法最初用来测定玉米种子中赖氨酸含量，改进的方法经济、准确和快速,可以用来测定大量玉米谷物中的有效赖氨酸。
此后越来越多的测定赖氨酸的方法被提出，如高效液相色谱（HPLC）法、氨基酸分析仪法等，这些方法大多都是以前的方法改进而来的，向更简单准确的方向发展。
1.2国内研究概况
国内对此研究的比较晚，但进展很快，取得的成果也很骄人。
我国比较早比较成熟的方法是赵铁男等（1982）提出的染料结合法（DBL）法，此法是他们在借鉴了国外的技术后提出的更简单更准确的方法，而且他们制定的标准曲线后来人也一直在用。
此外他们还在对实验结果进行分析后发现温度是DBL法测定稻米赖氨酸含量的主要影响因子，并通过实验证明,在室温范围内以18—34℃为最佳测定温度,低于18℃测定结果明显比仪器值偏低；金承泽（1988）提出用非水电位滴定法测定赖氨酸含量，此法按非水滴定原理使用自动电位滴定计能够准确简便地测定其含量。
张书贤（1996）提出了用旋光仪检测添加剂中赖氨酸含量的方法。
现在又有一些的研究方法如：
近红外光谱分析（NILS）法、生物传感器法等，可见国内赖氨酸测定方法已经很成熟，而且更准确方便。
1.3研究背景及意义
蛋白质是构成人体细胞的主要成份，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，然后人体又利用这些氨基酸再合成新的人体蛋白质，如免疫抗体、消化酶、血浆蛋白、生长激素等都是合成后的人体蛋白质。
在合成蛋白质的各种氨基酸中，赖氨酸（Lys）是最重要的一种，少了它，其它氨基酸就受到限制或得不到利用，所以它被称为是人体第一必需氨基酸。
赖氨酸学名二氨基己酸，化学结构简式为H2NCH2CH2CH2CH2CH（NH2）COOH，含有2个氨基（-NH2）和1个羧基（-COOH），是一种具有明显碱性的氨基羧酸。
按光学活性分,赖氨酸有L型（左旋）、D型（右旋）和DL型（消旋）3种构型。
只有L型才能为生物所利用，通常所说的赖氨酸均指L型。
L型赖氨酸呈针状晶体，在210℃变暗，在224.5℃下分解,易溶于水,微溶于醇，不溶于醚。
除了是第一必需氨基酸外赖氨酸还可以调节人体代谢平衡，往食物中添加少量的赖氨酸，可以刺激胃蛋白酶与胃酸的分泌，提高胃液分泌功效，起到增进食欲、促进幼儿生长与发育的作用。
赖氨酸为合成肉碱提供结构组分，肉碱负责将一些不饱和脂肪酸转化为能量，还有助于降低胆固醇水平。
在身体中赖氨酸还有其他功效。
它和其他营养一起形成胶原蛋白。
胶原蛋白在结缔组织，骨骼，肌肉，肌腱和关节软骨中扮演了重要角色。
此外，赖氨酸还能提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长。
如缺乏赖氨酸，会造成胃液分泌不足而出现厌食、营养性贫血，致使中枢神经受阻、发育不良。
赖氨酸在医药上还可作为利尿剂的辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起的铅中毒现象，还可与酸性药物（如水杨酸等）生成盐来减轻不良反应，与蛋氨酸合用则可抑制重症高血压病。
近年来，科学家还发现，赖氨酸是控制人体生长的重要物质抑长素（Somatotation,ss）中最重要的也是最必需的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用。
然而人体不能自身合成赖氨酸，必须从食物中获取。
自然界中动物蛋白质的赖氨酸含量较高，谷类则较低且在加工过程中易被破坏。
统计显示中国人均摄入肉食类食物远远低于世界平均水平，而且现代人类素食主义者在不断的增加，由于长期不吃动物类，这样就会出现越来越多的人赖氨酸摄入量不足，严重影响人们的健康。
所以为了解决赖氨酸供应不足的现状，我们需要从其他日粮作物中找到更多含有大量赖氨酸的食物，谷类中的赖氨酸含量普遍较少，到现在为止的科技手段仍然难以解决在谷类加工过程中赖氨酸被大量破坏的现状，这就需要从其他类日常使用的植物中着手，找到赖氨酸含量更多的食物来解决问题。
资料显示现在世界蛋白质产量的80％是植物蛋白，其中就包括16％以大豆为主的油料种籽蛋白。
所以选取大豆和豆科植物中的蚕豆为实验材料，通过实验研究其中的赖氨酸的含量并进行对比，以选取含赖氨酸多的物种用以日常使用或者工业生产。
大豆（学名：
Glycinemax），起源于中国，古称菽，汉司马迁（公元前145～前93年）编的《史记》中，头一篇《五帝本纪》中写道：
“炎帝欲侵陵诸侯，诸侯咸归轩辕。
轩辕乃修德振兵，治五气，鞠五种，抚万民，庆四方。
”郑玄曰：
“五种，黍稷菽麦稻也。
”司马迁在《史记*卷二十七》中写道：
“铺至下铺，为菽”，由此可见轩辕黄帝时已种菽。
”朱绍侯主编的《中国古代史》中谈到商代（公元前16世纪～前11世纪）经济和文化的发展时指出：
“主要的农作物，如黍、稷、粟、麦（大麦）、来（小麦）、秕、稻、菽（大豆）等都见于《卜辞》。
”卜慕华指出：
“以我国而言，公元前1000年以前殷商时代有了甲骨文，当然记载得非常有限。
在农作物方面，辨别出有黍、稷、豆、麦、稻、桑等，是当时人民主要依以为生的作物。
”清严可均校辑《全上古三代秦汉三国六朝文》卷一中指出：
“大豆生于槐。
出于沮石之峪中。
九十日华。
六十日熟。
凡一百五十日成，忌于卯。
”后来在朝鲜和日本也发现了从中国传播过去的大豆。
在中国种植大豆的历史有5000多年，中国学者大多认为原产地是云贵高原一带。
现在种植的栽培大豆是从野生大豆通过长期定向选择、改良驯化而成的。
栽培大豆以按生育期分类为主，中国将北纬22°～50°地区内的有代表性的品种，按其生育期长短，以10天为一级，从最早熟到最晚熟分为12级。
根据中国大豆气候区划，除了热量不足的高海拔、高纬度地区和年降水量在250毫米以下，又无灌溉条件的地区以外，一般均有大豆种植。
我国大豆的集中产区在东北平原、黄淮平原、长江三角洲和江汉平原。
根据大豆品种特性和耕作制度的不同，我国大豆生产分为五个主要产区：
一、东北三省为主的春大豆区
二、黄淮流域的夏大豆区
三、长江流域的春、夏大豆区
四、江南各省南部的秋作大豆区
五、两广、云南南部的大豆多熟区
其中，东北春播大豆和黄淮海夏播大豆是我国大豆种植面积最大、产量最高的两个地区
产区名称
地理位置
生长季
生长季≥0℃积温
栽培制度
东北春播大豆区
黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古东北部
140天左右
2700~2850℃
一年一熟，春播秋收
黄淮海夏播大豆区
天津、北京、石家庄一线以南，山东、河南大部分地区，江苏、安徽的北部，山西西南部、陕西的关中和甘肃南部
90~100天
2600~2800℃
一年两熟
大豆在各型内还按种皮色、按当地的实际生长日数和种粒大、中、小等分为不同的群。
各群再按有限、亚有限或无限结荚习性、灰毛或棕毛、紫花或白花等～3种性状，分成不同类型。
大豆的根有主、侧根之分，可入土1.5米深，呈钟罩状根系。
在地表至20厘米左右的土中根部生有根瘤，根瘤菌可供大豆需氮量的1/3～1/2。
主茎高60～100厘米，15～24个节，豆荚着生于节上，多节大豆常高产。
无限结荚习性适应肥水较差的条件种植。
有限结荚习性适于肥水较好地区种植。
亚有限结荚习性的则介乎于二者之间。
大豆叶为三出复叶。
花蝶形。
荚果呈黄、黑、褐色，弯镰形或直葫芦形。
大豆为短日照作物，品种间对短日照的敏感性差别大。
大豆是豆类中营养价值最高的品种，在百种天然的食品中，它名列榜首，由于它的营养价值很高，被称为“豆中之王”、“田中之肉”、“绿色的牛乳”等。
其中含有大量不饱和脂肪酸、多种微量元素、维生素、异黄酮、低聚糖、皂苷、磷脂、核酸和优质蛋白质。
大豆卵磷脂是从大豆中提取的精华物质。
也是人体需要的脂类成分之一，主要作用在于：
延缓衰老、血管清道夫、预防心脑血管疾病、构成生物膜的主要成分，还具有防止肝脏内积存过多脂肪的作用，从而有效地防治因肥胖而引起的脂肪肝；大豆中含有的可溶性纤维，既可通便，又能降低胆固醇含量；大豆异黄酮是一种结构与雌激素相似，具有雌激素活性的植物性雌激素，能够减轻女性更年期综合征症状、延迟女性细胞衰老、使皮肤保持弹性、养颜、减少骨丢失，促进骨生成、降血脂等；大豆中含有一种抑制胰酶的物质，对糖尿病有治疗作用。
大豆所含的皂甙有明显的降血脂作用，同时，可抑制体重增加。
除去以上营养物质以外，大豆中有丰富的蛋白质，含量约为38%，是谷类食物的4～5倍。
大豆蛋白质的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均较丰富，是植物性的完全蛋白质，在营养价值上，可与动物蛋白等同。
FAO/WHO（1985）人类试验结果表明，大豆蛋白必需氨基酸组成较适合人体需要，对于两岁以上的人，大豆蛋白的生理效价为100。
大豆中富含蛋白质，其蛋白质含量几乎是肉、蛋、鱼的二倍。
而且大豆所含的蛋白质中人体“必需氨基酸”含量充足、组分齐全，属于“优质蛋白质”。
大豆蛋白中含有的多种人体必需的氨基酸约50％为赖氨酸，所以说大豆是补充谷类蛋白质氨基酸不足的优良食品。
如果这部分可观的油料种籽蛋白得到充分利用，则对解决人类蛋白质供应不足具有很大的意义。
蚕豆（学名：
ViciafabaLinn），一年生或二年生草本。
蚕豆一般认为起源于西南亚和北非。
中国蚕豆相传为西汉张骞自西域引入。
自热带至北纬63°地区均有种植。
中国以四川最多，次为云南、湖南、湖北、江苏、浙江、青海等省。
蚕豆，又叫胡豆，佛豆，江南一带，喜欢在立夏时节食豆，因此又称作立夏豆。
宁波人则习惯叫倭豆，而且在立夏前后，几乎是家家户户都吃蚕豆，都喜欢吃蚕豆，不少人家还将蚕豆跟大米饭一锅煮，称为“蚕豆饭”。
据《太平御览》记载，蚕豆是张骞出使西域时带回的豆种。
确实，蚕豆既是粮食，又是小菜，既是“闲食”，又是补品。
笔者孩提时住在三北（今浙江慈溪）乡下。
三北农村多为咸田（土质含有盐份，系海涂演变而成），地里种植的不是蚕豆，就是棉花。
在每年四、五月份蚕豆成熟季节，许多人家把蚕豆既当菜吃，又当饭吃。
而城市则多把蚕豆当小菜吃。
而晒干后的蚕豆则既可当小菜吃，又可当“闲食”吃。
至于建福一带，据说还视蚕豆为上等滋补佳品，身价远在桂圆之上。
蚕豆的根系较发达，可入土层60～100cm，根瘤形成较早。
茎方形、中空、直立、茎的分枝力强，可从基部生长4～5个或8～10个以上的分枝。
叶互生，为偶数羽状复叶，小叶椭圆形，在基部互生，先端者为对生。
花腋生，总状花序。
花冠紫白色或纯白色。
每花序有2～6朵花，第一至二朵花一般能结荚其后的花结荚率低。
荚为扁圆筒形内有种子坚硬呈绿褐色或淡绿色，扁圆形。
千粒重900～2500克。
蚕豆具有较强的耐寒性，种子在5～6℃时即能开始发芽，但最适发芽温度为16℃。
幼苗能忍耐-5℃左右的低温，-6℃时易冻死。
生长的适温为20～25℃。
蚕豆对光照要求不严格，对土壤水分要求较高，适宜于冷凉而较湿润的气候。
对土壤的适应性较广，沙壤土、粘土、水田土、碱性土等均可栽培，对土壤营养的要求，在未形成根瘤的苗期，宜适量施用氮肥。
对磷、钾需要量也较大。
镁硼对蚕豆生育有良好的作用。
土壤缺硼，则易妨碍根瘤菌的繁殖，使植株生育不良。
为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物。
蚕豆的医疗作用，前人早有记述，说蚕豆茎、叶、花、荚壳和种皮均可入药。
明代《群芳谱》记载：
蚕豆“味甘微辛平无毒，快胃、和脏腑、解酒毒。
主要功能：
健脾、除湿、通便、凉血”。
据《中医学大辞典》介绍，蚕豆有健脾除湿、通便凉血的功能，治疗小便频数、咳血、鼻衄有显著疗效。
蚕豆性味甘平，微辛。
除食用外，还有快胃、祛湿、利脏腑，“补中益气，涩精实肠”等功能，可用于治疗多种疾病。
现代研究表明蚕豆中含有调节大脑和神经组织的重要成分钙、锌、锰、磷脂等，并含有丰富的胆石碱，有增强记忆力的健脑作用。
蚕豆中的蛋白质含量丰富，且不含胆固醇，可以提高食品营养价值，预防心血管疾病。
但是具体蚕豆中含有的赖氨酸含量还很少有人研究，所以这方面的数据基本为空白。
如果实验的结果中显示蚕豆中也含有大量的赖氨酸那么它将也成为补充谷物赖氨酸含量不足的又一种豆类植物。
鉴于赖氨酸的重要性何在谷物中的的较低含量，因此，从豆类食品中获得可利用的优质赖氨酸以解决赖氨酸供应不足的现状已经变得尤为重要，各国科学家都在致力寻找到最快速简便地测定赖氨酸含量的方法，以期发现更多的大量含有赖氨酸的日常食物解决此问题，这也是本次试验的主要目的。
2材料与方法
2.1材料
大豆、蚕豆、95﹪乙醇液、50﹪乙醇液、异亮氨酸、盐酸、蒸馏水、活性炭、茚三酮、二氧化锡、柠檬酸、柠檬酸三钠、氢氧化钠。
2.2器具
分光光度计、滤纸、三角瓶、玻璃棒、比色皿、电子天平、水浴锅、温度计、试管、试管塞、研磨机、60目筛子、冰箱、干燥器、漏斗、滤纸、容量瓶。
2.3实验方法
（1）样品前处理：
将自然干燥的大豆和蚕豆分别用研磨机粉碎，过60目筛子，在343~353K温度下干燥，置于干燥器中备用。
（2）溶液的配置：
a、0.2mol/L柠檬酸缓冲液：
称取2.10g柠檬酸和2.94g柠檬酸三，钠，水解于50ml蒸馏水中，调pH至5.0.
b、茚三酮试剂：
先将茚三酮重结晶即称取5g茚三酮溶于15ml蒸馏水，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。
若溶液太浓不易操作，可酌量加入5－10ml热水。
加热30min后趁热过滤（最好用热滤漏斗），滤液放冰箱过夜。
次日晨即可析出黄白色结晶，抽滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装入棕色试剂瓶内保存。
再称取1.0g茚三酮溶于25ml95%乙醇中，称取40.0g二氧化锡溶于25ml柠檬酸缓冲液中，将两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液至于4℃冰箱中备用。
c、异亮氨酸标准液：
准确称取5.0mg异亮氨酸，加数滴0.02mol/L盐酸溶解，然后用蒸馏水稀释定容至100ml，则得到浓度为50ug/ml的标准液。
d、样品水解液的配制:
准确称取0.1000g样品于100ml三角瓶中，加入10ml16mol/L盐酸盖严，于373K水解24h，加入少许活性炭脱色，过滤，以稀盐酸洗涤残渣，滤液加热混发除去部分盐酸，用氢氧化钠溶液调至中性，再加热挥发至体积少于15ml，转入25ml容量瓶中定容备用。
（3）标准曲线的制作：
取7只洁净带塞试管编号，按表1分别向每只试管中添加试剂，再向以上每只试管中加1.00ml茚三酮试剂，摇匀后塞紧试管塞，至于沸水浴加热5min，用冷水冷却试管至室温，再向每只试管中加50﹪乙醇8.0ml，混匀后用1㎝比色管于556nm处测吸光值，以所得吸光度为纵坐标，异亮氨酸浓度为横坐标制作标准曲线。
表1标准曲线的制作
试管编号0123456
取异亮氨酸标准液（ml）00.100.200.300.400.500.60
加蒸馏水（ml）1.000.900.800.700.600.500.40
异亮氨酸浓度（ug/L）050100150200250350
（4）样品测定：
以与标准曲线测定相同的步骤及条件测定两种样品的吸光度值。
2.4结果计算
样品中赖氨酸含量（%）=从标准曲线上查的值（ug）/样品重（mg）×样品稀释倍数×10－3×100
由于异亮氨酸与赖氨酸的分子量不相同，所以用异亮氨酸标准曲线计算赖氨酸时，需要乘以校正系数1.1515，同时还应从最后的结果中间去游离氨基酸的含量。
3结果与分析
3.1根据试验中测得的异亮氨酸标准液的吸光度值，绘制标准曲线（图1）
图1异亮氨酸标准曲线
对图1数据进行回归分析，回归方程为：
y=0.005078x+0.04775。
3.2根据异亮氨酸标准曲线和大豆的吸光度值计算出打斗中赖氨酸，见表2
表2大豆样液吸光值及赖氨酸的含量
试管编号
1
2
3
4
5
6
吸光值A
0.155
0.151
0.159
0.157
0.156
0.157
赖氨酸含量
1.68%
1.59%
1.77%
1.73%
1.70%
1.73%
计算赖氨酸含量的平均数为1.70%，方差为0.00000032.
3.3根据异亮氨酸标准曲线和蚕豆的吸光度值计算出打斗中赖氨酸，见表3
试管编号
1
2
3
4
5
6
吸光值A
0.092
0.089
0.086
0.087
0.088
0.088
赖氨酸含量
0.85%
0.79%
0.72%
0.74%
0.76%
0.76%
计算出蚕豆中赖氨酸含量的平均数为0.77%，方差为0.000000173.
4结论与讨论
4.1结论
（1）实验的结果表明，用此方法测定豆类中赖氨酸的含量充分可行，由大豆和蚕豆的含量方差可以看出，该方法稳定性和重现性都比较好，所用的试剂稳定，吸光度与异亮氨酸含量呈良好的线性关系，实验结果稳定可靠。
（2）实验结果表明在大豆中含有大量的赖氨酸，含量在16%左右，所以与预期的结果一样大豆可以用来大量生产和日常食用，用其代替动物类食物，补充人体及动物体内的赖氨酸，以解决赖氨酸不足的困境。
（3）蚕豆中的赖氨酸含量明显比大豆中少很多，只有10%左右，这样在生产与加工中如果单从赖氨酸含量反方面考虑，那么应该优先选择用大豆作为原料进行生产加工，而且大豆比蚕豆高产，对于生长环境的选择也比大豆要宽泛很多。
在中国大豆的历史悠久，加工技术也很成熟，食品方面自古以来就有很多种食用大豆的制作方法，经过现代技术的加工口味更好，相信完全可以代替谷物在生活总得重要地位，成为主流食物。
动物方面，大都已经广泛应用在了各种饲料的加工中，用以补充动物的赖氨酸摄入量，使其更加有营养的生长。
4.2讨论
大豆和蚕豆的赖氨酸含量具有明显差异，此差异的存在在于二者的组成结构上的不同。
大豆的主要成分为蛋白质，大约占40%，蛋白质由各种氨基酸组成，实验的结果又显示赖氨酸在所含氨基酸中占据主要的位置。
而在蚕豆中，各种金属元素和微量元素以及胆石碱占有很重要的位置，它的蛋白质含量要比大豆中少，而实验表明，赖氨酸在所含氨基酸中并不占主要地位，所以含量要比大豆中少很多。
致谢
本论文是在导师肖红梅老师的悉心指导下完成的。
多年来，恩师在我的学士学位课程学习，实验研究、教学活动、学术交流、论文撰写和工作生活等方面都给予了极大的关怀和支持，并为我提供了良好的学习研究环境。
导师的严谨治学、孜孜不倦、持之以恒的师表风范是我终身学习的楷模，在此向恩师表示诚挚的感谢和崇高的敬意！
同时感谢其他关心、帮助和支持我的老师和同学们！
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