反义肽核酸抗病毒药物在兽医临床.docx

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反义肽核酸抗病毒药物在兽医临床

反义肽核酸抗病毒药物在兽医临床

的应用与研究（猪病篇）

病毒是一类超显微的、不具有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。

它由一种核酸（DNA或RNA）和蛋白质组成,没有酶或酶系统极不完全,不能进行独立的代谢作用,必须寄生在宿主细胞内,借助于宿主细胞的代谢系统复制自身的核酸和蛋白质才能繁殖。

•病毒的生活史分为5个基本过程：

•吸附（absorption）：

病毒对细胞的感染起始于病毒蛋白外壳同宿主细胞表面特殊的受体结合，受体分子是宿主细胞膜或细胞壁的正常成分。

因此，病毒的感染具有特异性。

•侵入（penetration）：

病毒吸附到宿主细胞表面之后，将它的核酸注入到宿主细胞内。

•复制（replication）：

病毒核酸进入细胞后有两种去向，一是病毒的遗传物质整合到宿主的基因组中，形成溶原性病毒；第二种情况是病毒DNA（或RNA）利用宿主的酶系进行复制和表达。

•成熟（maturation）：

一旦病毒的基因进行表达就可合成病毒装配所需的外壳蛋白，并将病毒的遗传物质包裹起来，形成成熟的病毒颗粒。

•释放（release）：

病毒颗粒装配之后，它们就可从被感染的细胞中释放出来进入细胞外，并感染新的细胞。

有些病毒释放时要将被感染的细胞裂解，有些则是通过分泌的方式进入到细胞外。

在临床流行性的疾病所导致的损失中,约有70%疾病损失是由病毒性疾病导致,所以病毒性疾病是影响养殖业健康发展和盈利的关键因素。

•近年来,由于从国外引种及进口动物源性饲料原料，饲养管理模式的改变等导致病毒性疾病发生和控制愈渐复杂,养殖场普遍面临着新增的病毒性疾病与老病新发的病毒性疾病双重夹击的困扰，造成生产上极大的损失，对养殖业的健康发展形成了巨大的障碍。

但就目前的抗病毒药物的品种结构而言,可供临床使用的药物比较有限,远不能满足生产上预防和治疗病毒病的需要。

寻找新的有效的抗病毒药,特别是对病毒具有高度选择性、而对宿主细胞无毒害的药物仍是当前迫切的需要。

在这种特殊时期，yebatonTM应时而生，将会给中国乃至世界的养殖场所遭受的病毒感染带来新的控制方案。

•SENNANBIO.下属的中国新药研发中心（NDDC）与美国CornellUniversity基因工程药物研究中心技术合作，将反义技术和反义寡核苷酸药物（yebatonTM）这一全新的“沉默基因”治疗技术引用到兽医临床，为当前愈见复杂的病毒性疾病的药物有效控制提供了新的途径。

•SENNANBIO.针对猪、家禽和虾的主要传染病设计合成的yebatonTM（反义脱氧寡核苷酸），具有较强的抗病毒活性。

体外实验表明本品对猪的（猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒）；禽的（流感病毒、新城疫病毒、传支病毒、鸭肝炎病毒、法氏囊病毒）；对虾的（白斑综合征（WSS）病毒和桃拉综合征（TS）病毒）显示出极强的抗病毒作用。

•目前在兽医临床上尚无任何抗病毒化合物被许可使用，yebatonTM对于DNA病毒和小RNA病毒的控治以其良好的药代动力学特征、广谱的抗病毒作用、广泛的临床适应症以及良好的耐受性和无毒副作用的特点,将会为养殖业的健康发展和畜禽病毒性疾病的控治做出重要的贡献。

yebatonTM是指建立在反义技术（Antisensetechnology）的基础上，采用人工合成的反义脱氧寡核苷酸经特殊工艺修饰制备的基因工程抗病毒免疫增强新药，这种基因片段药物（DNA及RNA片段）是与病毒DNA或RNA互补的核酸序列,能与病毒基因链的保守核苷酸序列（即mRNA）杂交,形成稳定的互补结构,选择性地干扰或封闭基因表达、阻断病毒基因正常复制，以达到治疗病毒病目的的新型治疗技术，被称之为“沉默基因”或“生物导弹”给药技术。

•相对广谱性（针对危害猪群主要病毒（HCV\PRRSV\PCV2\PRV\SIV）设计的反义脱氧寡核苷肽）

•高效性（病毒性疾病良好的控制效果）

•最优化的药物设计（可以和任何化学药物及中药混合复配）

•长期投药无毒，安全。

•针对病毒目的基因作用，不产生耐药性。

yebatonTM的空间结构

yebatonTM运用基因工程技术合成并以肽骨架修饰手段对反义寡核苷酸进行修饰形成聚合物，从而弥补天然结构核酸药物抗病毒时效短暂、在机体内生物利用度低，易被核苷酸酶降解的缺陷，不但使之在体内的半衰期明显延长，而且使核酸药物具有稳定的理化性能和相对广谱抗病毒活性。

yebatonTM的低聚壳聚糖修饰微囊结构特点我们采用低聚壳聚糖靶向定点控释技术将经肽骨架修饰的反义寡核苷酸药物基因片段制备成结肠溶控释微囊，猪口服yebatonTM微囊后，经过胃、小肠的逐步消化控释衣壳，直到结肠部位才会将大量的有效成分（反义寡核苷酸）释放，保证绝大多数有效药物分子在结肠部位吸收，具备更高水平的生物利用率，这种控释制剂工艺是保证生物活性药物经口服后不被消化道内酶破坏的理想技术。

以壳聚糖为载体的口服基因药物（摘要）

长期以来,基因药物的给药以注射途径为主,是因为口服给药存在多种限制因素,如胃中的低pH可使DNA脱嘌呤化,消化酶易降解治疗基因,常用基因载体难以被肠上皮细胞摄取等,相关释药技术的发展明显滞后于基因药物本身的发展[1]。

作为一种天然的阳离子聚合物,低聚壳聚糖不仅易与带负电荷的DNA等遗传物质结合而形成纳米微粒,还具有无毒、易获得、生物可降解、稳定、生物相容、能抵抗胃肠道环境（pH、核酸酶）对药物的破坏、生物黏附性强、可促进药物渗透吸收等优点,日益成为口服基因药物的优良载体。

yebatonTM（肽核酸）经口服进入体内后与特异宿主细胞结合，在酶的催化作用下脱去肽骨架，导入细胞内，识别并激活2’、5’-寡腺苷酸合成酶，被活化的寡腺甘酸可以使潜伏在体内的内源核酸酶（核酸内切酶-Dicer）活化，在RNA诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-inducedsilencingcomplex）作用下，对（病毒）靶基因mRNA进行切割，引起病毒复制环节能力丧失，从而达到抗病毒的作用。

yebatonTM所独特的拟病毒结构，进入机体后可被免疫系统误认为是遭受到病毒攻击从而激活机体的特异性和非特异性的免疫防卫机能。

对其免疫调节抗肿瘤机制的研究表明，其主要作用是激活自然杀伤细胞（NK细胞）、T、B淋巴细胞、巨噬细胞活性、诱导机体产生多种干扰素、多种细胞介素，从而达到预防和治疗病毒病，修复机体免疫缺陷的作用。

森楠生物新药研发中心的研究人员在长达六年的实验室研究和众多猪、禽场进行临床应用性研究，结果表明：

疫百特（yebatonTM）对猪、禽临床常见多种病毒性疾病具有很好的预防和理想、经济的治疗效果。

将Marc-145细胞培养成单层，yebatonTM转染，以生理盐水作对照，24h

后接种蓝耳病毒（PRRSV）。

病毒感染72h后通过病毒空斑测定评价yebatonTM

对病毒复制的抑制效果。

空斑试验：

收集待检测细胞和上清，经反复冻融3次后各吸取100μL，用MEM做

10倍梯度稀释后，分别接种于已长成单层的Marc-145细胞上,吸附1h，吸弃病毒

液，加入2mL琼脂糖覆盖液，37℃继续培养，待出现明显病变形成空斑后，用1：

1000倍稀释的中性红染色1h，弃去中性红染色液，数空斑数目，利用t检验对数据进行显著性分析。

•只有尽快实施“三位一体”的健康管理模式（系统的免疫检测、科学的疫苗接种程序、Yebaton脉冲式保健方案），才是猪场重大病毒性疾病控制及清除计划的最佳手段

影响猪群免疫效果的主要因素病毒性传染病的控制，一直以来都是依赖疫苗的免疫接种，不可否认，对于传染病的控制，疫苗的免疫接种是最基础的、最经济的、最主动的措施，但是面对当前畜禽传染病的发生现状，仅仅依赖疫苗的免疫接种来控制传染病已明显感到不足。

•免疫受体（猪群）的免疫状态（如:

免疫抑制、免疫麻痹、免疫缺陷、免疫遗漏）。

–这种现象通过疫苗（特异性抗原）是消除或缓解不了的，必须要通过非特异性免疫增强剂参与抗原协同工作，先将免疫受体的免疫状态调节正常，这样机体免疫系统才能对抗原产生正常的免疫应答。

•野毒的免疫干扰和免疫占位现象

–我国猪场的猪瘟为什么总是防不好？

追究其根本原因就是猪群普遍遭受野毒持续侵染导致带毒密度过大，与疫苗弱毒竞争宿主细胞后致使免疫状态不稳定。

yebatonTM做为免疫增强剂提高疫苗免疫效果在免疫接种前后各5天连续使用,可解除猪群免疫抑制、改善免疫状态、弥补免疫遗漏、减轻病毒感染压力、提升灭活疫苗及活疫苗免疫效果的完美方案！

yebatonTM抗病毒又为何提高活疫苗免疫效果？

活病毒感染的第一个阶段是在机体的淋巴系统（在淋巴系统完成细胞免疫应答）。

弱毒苗是人工致弱的病毒，正常情况下在机体淋巴系统完成细胞免疫应答后，致弱活病毒都会被抗原递成系统转化成抗体，即使有少量的弱毒在淋巴系统增殖后逃逸到血液循环系统并出现一过性的轻微临床症状（轻微的病毒血症）也会很快的被血液系统里存在的特异性抗体；巨噬细胞、NK杀伤细胞等构成非特异免疫系统细胞所控制住。

而野毒（非致弱活病毒）往往会在淋巴系统内大量的增殖并涌入血液循环系统，并随着血液循环直接进入实质性脏器（如肺脏、肾脏、肝脏、脾脏等）并将这些脏器上的特定健康细胞作为第二宿主细胞而进行再次的破坏，导致脏器的坏死、出血等病变从而引起脏器的代谢功能紊乱等一系列临床表现从而发病甚至死亡。

yebatonTM抗病毒是发生在血液循环系统，主要在受病毒感染的宿主细胞内阻断病毒基因表达复制从而达到抗病毒目的。

而对存在淋巴系统的病毒（弱毒或野毒）作用不到，所以不会影响弱毒疫苗所诱导的细胞免疫应答过程。

猪场应用yebatonTM之母猪阶段式病毒控制方案

据调查资料显示，我国目前母猪年贡献成品肉猪的生产水平不到发达养猪国家的70%，大量的母猪存在不同程度的繁殖障碍，由于母猪的生产性能低下，又加上疾病的频频发生，猪场的盈利危机四伏。

在猪场中有着相当多的母猪表现出的屡配不孕、死胎、流产、产弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亚临床现象。

存在的这些现象中，有80%是由于母猪的野病毒持续感染所致。

在生产中，采用yebatonTM每个月连用10天的阶段式病毒控制方案是解决这些问题的关键！

猪场应用yebatonTM之保育仔猪三段式病毒控制方案猪群生长过程中在哺乳后期--保育中期这50天左右的时间是最容易感染病毒性疾病、死亡率最高、饲养技术要求最高最复杂的一个阶段，目前由于母猪持续带毒后往环境排毒，产房环境严重被病毒污染等导致初生乳猪病毒感染及先天性免疫机能低下、出生后每天承受着野毒的高感染压力，母源抗体加速消耗、疫苗免疫程序紊乱的情况越来越严重，由此导致的哺乳阶段和保育前期发病率、死淘率明显增加、兽医工作强度大、生产用药成本高而且也解决不了问题。

在保证猪群健康管理工作中，病毒感染是这一时期尤其要注重的，在猪群断奶前一周开始，yebatonTM拌料用10天，隔7天；用10天、隔7天；再用10天的（10-7-10-7-10）的三段式病毒控制方案，可以有效的解除猪瘟、蓝耳病、圆环病毒、伪狂犬等重大疾病的困扰。

混饲每1000kg饲料用量

在猪群遭受应激因素困扰（如，寒冷、高温、转群、分娩、注射）和高感染压力期间等前后5天，建议使用疫百特2kg/吨饲料。