结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册技术审查指导原则模板.docx

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结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册技术审查指导原则模板

结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂

注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是针对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需阐述具体理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对注册申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

本指导原则所述结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂是指：

利用分子生物学技术，对结核病患者的临床样本或培养物样本中的结核分枝杆菌复合群耐药基因突变进行体外定性检测的试剂。

针对该定义，需要强调如下几点。

1.适用人群为：

结核病患者。

特别注意的是，对于同一注册单元内可同时进行结核分枝杆菌复合群核酸检测以及耐药基因突变检测的双功能试剂，尽管其核酸检测部分的适用人群为疑似结核病患者，但只有核酸阳性才能进行下一步的耐药基因突变检测，因此其耐药基因突变检测部分的适用人群为结核病患者。

2.适用样本可为：

2.1痰、支气管肺泡灌洗液或其他体液等临床样本或培养物样本；

2.2进行结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测的上述样本应为结核分枝杆菌复合群阳性的样本。

即：

来自结核病患者的、结核分枝杆菌复合群阳性的痰、支气管肺泡灌洗液或其他体液等临床样本或培养物样本。

3.结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法可为：

已获国家食品药品监督管理总局批准上市的结核分枝杆菌复合群检测试剂或临床普遍认可的结核分枝杆菌复合群鉴定方法（如：

结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂或传统的结核分枝杆菌复合群培养鉴定方法）。

4.对于同一注册单元内可同时进行结核分枝杆菌复合群核酸检测以及耐药基因突变检测的双功能试剂，其耐药基因突变检测部分适用于本指导原则。

本指导原则所述产品的预期用途可表述为以下三种类型：

1.申报产品可区分具体突变类型，结果报告具体突变类型（a类）。

建议表述为：

本产品用于体外定性检测来自结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中的yy耐药基因突变，可检测的突变类型包括zz，本产品可区分具体突变类型。

2.已知申报产品可检测的具体突变类型（如：

针对具体突变类型设计特异突变探针，从检验原理上已知可检测哪些突变类型），但结果不区分具体突变类型，结果报告为耐药/敏感等（b类）。

建议表述为：

本产品用于体外定性检测来自结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中的yy耐药基因突变，可检测的突变类型包括zz，本产品不区分具体突变类型。

3.某段核酸区域的突变可导致对某种药物耐药，申报产品从检验原理上没有必要明确具体突变类型，结果报告为耐药/敏感（c类）。

建议表述为：

本产品用于体外定性检测来自结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中的yy耐药，本产品无法明确具体突变类型。

本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于线性杂交或基因芯片等其他核酸检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，注册申请人可根据产品特性选择合适的方法进行评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。

本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从检测靶标、方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。

若尚无同类产品批准上市，则应提交详实充分的科学证据，包括：

突变区域、突变类型与结核分枝杆菌复合群表型耐药的相关性以及突变检测的临床意义，证明申报产品的检测靶标具有明确的临床意义。

综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。

（二）主要原材料的研究资料

应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等相关研究资料。

若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交工艺验证报告；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：

供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.核酸分离纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

2.PCR组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：

2.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：

dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；应提交对纯度、浓度以及保存稳定性等的验证资料。

2.2引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。

需提供对分子量、纯度、稳定性以及功能性实验等的验证资料。

如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。

2.3探针

特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。

合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化，在5-端（和/或3-端）进行标记，并经HPLC或其他适宜方法纯化，纯度应达到HPLC纯。

应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分子量、纯度及标记的荧光素进行核实，并进行功能性试验验证。

2.4酶

DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：

94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。

应对酶活性进行合理验证。

3.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）污染。

4.企业参考品：

详细说明企业参考品的原料选择、制备和定值过程等试验资料。

4.1阳性参考品

应包括申报产品声称的全部突变类型。

阳性参考品的突变类型需经过金标准方法或已上市同类分型试剂的确认。

常见突变类型的阳性参考品至少有1—2种突变类型采用菌株，其他突变类型的阳性参考品可以采用含有突变的核酸（如：

结核分枝杆菌基因组DNA或质粒），不建议采用临床样本（如痰液）作为阳性参考品。

注册申请人可根据权威机构的最新文件或文献等确定常见突变类型，并提交相应的支持资料。

4.2阴性参考品

可采用经确认靶序列未发生突变的结核分枝杆菌菌株、申报产品声称的其他无关突变类型的核酸等。

4.3最低检测限参考品

最低检测限参考品须含有声称的所有突变类型。

常见突变类型的最低检测限参考品至少有1—2种突变类型采用菌株，其他突变类型可采用含有突变的核酸。

常见突变类型的确定方法可参考本指导原则的“4.1阳性参考品”。

4.4精密度参考品

精密度参考品至少应包括弱阳性（低浓度突变型）水平，须含有申报产品声称的所有突变类型。

常见突变类型的精密度参考品至少有1—2种突变类型采用菌株，其他突变类型可采用含有突变的核酸。

常见突变类型的确定方法可参考本指导原则的“4.1阳性参考品”。

对于c类预期用途的产品，申请人应尽可能对国内已报告的耐药核酸区域内的常见突变类型设置上述各种类型的企业参考品。

常见突变类型的确定方法可参考本指导原则的“4.1阳性参考品”。

对于利福平耐药基因突变检测试剂，阳性参考品、最低检测限参考品以及精密度参考品至少应包括4—5种常见突变类型，并且至少有1—2种突变类型采用菌株。

对于其他药物的耐药基因突变检测试剂，阳性参考品、最低检测限参考品以及精密度参考品至少应包括耐药相关的常见突变类型，并且至少应有1—2种突变类型采用菌株，突变类型的数量可根据申报产品的具体情况而定。

5.试剂盒内的对照

申报产品的质控体系通过设置各种对照来实现，以对样本核酸分离纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理质控。

申报资料应详细说明各种对照的原料选择、制备和定值过程等。

本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于采用该方法学的结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂，建议至少设置阳性对照、内对照和阴性对照。

5.1阳性对照

阳性对照可对实验过程进行质控。

阳性对照可采用菌株、质粒或基因组提取物等。

企业应对阳性对照相应判断数值做出明确要求。

5.2内对照

内对照可对实验过程的假阴性结果进行质量控制。

内对照可采用质粒或线性DNA等。

申请人应对内对照的引物、探针和模板浓度做精确的验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性又要尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制而导致假阴性。

企业应对内对照或相应判断数值做出明确要求。

5.3阴性对照

阴性对照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白对照，以对交叉污染造成的假阳性结果进行质控。

阴性对照需参与样本核酸的平行提取纯化。

由于申报产品所适用的临床样本比较复杂，其中可能含有各种影响PCR反应的抑制物，造成假阴性。

因此，申报产品应充分考虑对样本核酸提取纯化环节的质量控制，通过设置各种对照进行质控。

比如，采用克隆菌株作为内对照或阳性对照并参与样本核酸的平行提取纯化，或者设置专门的核酸提取纯化对照（如菌株）等，以对样本核酸提取纯化的质量及效率进行评估。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

生产工艺及反应体系的研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件和质控体系设置等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率、离子浓度等关键参数进行有效控制。

主要包括以下内容：

1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。

2.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度以及阳离子浓度等。

3.PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

4.对于基线阈值和阈值循环数等确定的研究资料。

5.如申报产品包含核酸提取纯化试剂，应提交对核酸提取纯化过程进行工艺优化的研究资料。

（四）分析性能评估资料

申请人应提交对申报产品进行的所有性能验证的研究资料，包括具体试验方法、内控标准、实验数据和统计分析等详细资料。

该类产品建议着重对以下分析性能进行研究。

1.阳性/阴性参考品符合率

各突变类型的阳性参考品均应检出阳性/耐药，阴性参考品应检测为阴性/敏感。

其中，常见突变类型至少有1—2种突变类型采用耐药菌株，其他突变类型可采用含有突变的核酸样本。

常见突变类型的确定方法可参考本指导原则的“4.1阳性参考品”。

2.最低检测限

建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。

扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中突变序列的百分率越高、所含的DNA量越多，则越容易检出。

而终体系中的这两个因素是由临床样本中的结核分枝杆菌耐药菌与野生菌的含量和相对比例决定的。

因此，需从以下两个方面考察申报产品的最低检