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质量研究工作的试验资料及文献资料
质量研究工作的试验资料及文献资料
一、质量研究样品来源
1、卡莫氟软胶囊；规格:
50mg。
批号
理论产量（万粒）
实际产量（万粒）
060501
1
0.95
060502
0.93
060503
0.89
三批中试样品均在本公司符合GMP要求的车间生产制备。
2、卡莫氟对照品：
中国药品生物制品检定所，规格：
50mg，批号：
100352-200301。
二、质量研究
本品质量研究主要参照卡莫氟片质量标准（中国药典2005年版二部“卡莫氟片”）进行研究。
1、性状取本品三批检查，结果见表10-1。
表10-1外观性状检查结果
批号
060501
060502
060503
性状
内容物为微黄色乳状混悬液体
内容物为微黄色乳状混悬液体
内容物为微黄色乳状混悬液体
结论：
本品三批性状描述为：
内容物为微黄色乳状混悬液。
2、鉴别
2.1鉴别
（1）：
取三氧化铬的饱和硫酸溶液约1ml，置小试管中，转动试管，溶液应能均匀涂于管壁，加本品内容物适量（约相当于卡莫氟10mg），微热，转动试管，溶液应不能再均匀涂于管壁，而类似油垢存在于管壁。
方法的建立：
取本品三批内容物适量（约相当于卡莫氟10mg），照上述方法依法操作，结果显相同现象；另取空白辅料适量，照上述方法依法操作，无此现象。
2.2鉴别
（2）：
在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
方法的建立：
取本品三批依含量测定项下方法制成供试品溶液，取卡莫氟对照品依含量测定项下方法制成对照品溶液，照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录ⅤD）测定。
另取空白辅料适量，制成空白辅料溶液，同法测定。
结果表10-2。
表10-2 高效液相色谱鉴别结果
批号
060501
060502
060503
空白辅料
保留时间
与对照品保留时间一致
无干扰
结果表明，三批供试品的高效液相色谱主峰与对照品保留时间一致，且空白辅料不影响主药的鉴别。
3、检查
3.1溶出度
本品的溶出度测定方法参照卡莫氟片质量标准（中国药典2005年版二部）,并进行了质量研究。
3.1.1溶出介质的选择由于0.1mol/L盐酸溶液接近胃液，卡莫氟在乙醇中微溶，采用含不同乙醇量的0.1mol/L盐酸溶液中（250ml）对卡莫氟（12.5mg）进行溶解观察，并稀释制成每1ml中含有10μg的溶液分别测吸光度A。
在吸光度保持稳定的情况下，含醇量越低越能与生理状态相对应。
结果表明：
以含乙醇20%的0.1mol/L盐酸溶液作为溶出介质最佳。
3.1.2检测波长的确定精密称取经五氧化二磷干燥器减压干燥至恒重的卡莫氟原料约25mg，以含乙醇20%的0.1mol/L盐酸溶液溶解于250ml容量瓶中，精密吸取5ml置50ml容量瓶中，以0.1mol/L盐酸的溶液稀释至刻度，摇匀，此溶液在波长258nm处有最大吸收，空白溶液此处无吸收干扰。
选用258nm为测定波长。
3.1.3浓度与吸收的线性关系精密称取干燥至恒重的卡莫氟原料25mg置250ml容量瓶中，加50ml乙醇溶解后加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度摇匀。
分别吸取1、2、3、4、5ml置25ml容量瓶中．各加0.1mol/L盐酸溶液至刻度摇匀，于258nm波长处测定吸光度A，求得回归方程为：
A=0.0453C-0.0029（r=0.9999）。
图10-1浓度与吸光度线性关系曲线图
3.1.4稳定性试验配制卡莫氟高低二浓度（5μg/ml、10μg/m1）溶液两组，室温放置，分别经0.5、l、2、4、8小时于258nm波长处测定吸光度，表明卡莫氟在含20%乙醇的0.1mol/L盐酸溶液中能保持稳定。
3.1.5回收率试验精密称取干燥至恒重的卡莫氟约25mg，辅料约300mg于100ml容量瓶中．加含20%乙醇的0.1mol/L盐酸溶液适量，充分溶解后再加至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液，分别取1ml置50ml和25ml容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度摇匀得5μg/ml和10μg/ml溶液。
取卡莫氟原料25.0mg同法制备于258nm波长处测定吸光度A。
求得平均回收率为99.49%，RSD为0.33%。
3.1.6溶出曲线试验
样品：
卡莫氟软胶囊（批号：
060501）；取经超声仪脱气处理含20%乙醇的0.lmol/l盐酸液1000ml作溶出介质，采用RCZ一6B型溶出度仪，恒温至37±0.3℃，降下转篮，当样品与介质接触计时，转速100转/分，分别在5、l0、30、45、60、90分钟用针筒式微膜过滤器取样7ml（同时补充等量等温介质），精密吸取5ml置25ml容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度摇匀，另取经五氧化二磷干燥至恒重的卡莫氟对照品适量，精密称定，加少量乙醇使溶解并用上述溶剂定量稀释制成每1ml中含有8μg的溶液。
取上述两种溶液，于258nm波长处测定吸光度A。
测定结果并绘制溶出曲线图如下。
图10-2卡莫氟软胶囊溶出曲线图
方法：
取本品，照溶出度测定法（《中国药典》2005年版二部附录ⅩC第一法），以20%乙醇的0.lmol/L盐酸液1000ml为溶剂，转速为每分钟100转，依法操作。
经60分钟时，取溶液适量滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀；另取经五氧化二磷干燥至恒重的卡莫氟对照品适量，精密称定，加少量乙醇使溶解并用上述溶剂定量稀释制成每1ml中含有8μg的溶液。
取上述两种溶液，照分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣA），在258nm的波长处分别测定吸光度，计算出每粒的溶出量。
限度为标示量的70%，应符合规定。
3.1.3溶出度检查测定结果
取本品三批进行溶出度检查，依法测定，结果见表10-3。
表10-3溶出度检查结果
批号
1（%）
2（%）
3（%）
4（%）
5（%）
6（%）
平均值%
060501
100.5
91.33
100.7
101.7
97.67
99.55
98.6
060502
101.0
98.84
99.78
97.43
98.37
98.14
98.9
060503
99.31
99.78
96.73
98.14
98.37
100.5
98.8
本品三批溶出度检查结果均符合规定，本品处方及生产工艺是合适的。
3.2崩解时限：
取本品三批样品照（《中国药典》2005年版二部附录XA）崩解时限检查法依法测定。
检查结果如表10-4。
表10-4崩解时限检查结果
批号
060501
060502
060503
崩解时间（min）
15
15
15
试验结果表明，本品崩解时限基本一致，三批均符合质量标准。
3.3装量差异
取本品三批，依法检查（《中国药典》2005年版二部附录ⅠA），取本品20粒，分别精密称定重量后，倒出内容物，囊壳用乙醚洗净，置通风处挥尽乙醚，再分别精密称定囊壳重量，求出每粒内容物的装量与平均装量。
结果见表10-5。
表10-5装量差异检查结果
批号
060501
060502
060503
平均装量（g）
0.6619
0.6544
0.6653
装量差异
符合规定
符合规定
符合规定
结论：
装量差异均符合质量标准要求。
3.4、微生物限度检查
3.4.1卡莫氟软胶囊微生物限度检查方法学验证
（1）供试品：
卡莫氟软胶囊（060501、060502、060503）
（2）菌种：
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（B）98001]、黑曲霉菌[CMCC（B）98003]
（3）培养基：
营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基
（4）试验方法：
1、按中国药典2005版二部“微生物限度检查法”中常规法和稀释法检验。
2、细菌、霉菌及酵母菌计数
按照中国药典2005版微生物限度检查法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
（5）菌液制备：
1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7稀释级，使含菌数为50～100cfu/ml。
2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7稀释级，使含菌数为50～100cfu/ml。
3、接种黑霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加无菌氯化钠溶液3～5ml洗下霉菌孢子，吸出菌液，取菌液1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4稀释级，使含菌数为50～100cfu/ml。
（6）供试液制备：
取供试品5g，加至含溶化的（温度45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物中，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,搅拌使供试品充分乳化，制成1：
20的供试液。
（7）验证方法
1、菌液组
分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定菌液中每1ml含活菌数，测定结果见表10-6。
2、供试品对照组
取供试液2ml，加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2～5天观察结果。
测定供试品本底菌数。
测定结果见表10-7。
3、试验组
取供试液2ml，按供试品对照组同法操作，同时加入各试验菌50～100cfu，置规定温度培养2～5天观察结果。
测定结果见表10-8、表10-9。
4、稀释剂对照组
分别取各试验菌500～1000cfu，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml。
分别取1ml按供试品对照组同法操作,置规定温度培养2～5天观察结果。
测定结果见表10-10、表10-11
（8）试验结果：
表10-6菌液组菌落计数（cfu/ml）
试验
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
大肠埃希菌
1
94
78
73
104
56
2
86
82
72
112
62
平均
90
80
72
108
59
表10-7供试品对照组菌落计数（cfu/g）
样品
细菌数
霉菌及酵母菌数
1
2
平均
1
2
平均
0
0
0
0
0
0
表10-8试验组菌落计数（cfu）
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
大肠埃希菌
1
62
66
58
81
48
2
71
70
50
77
52
平均
66
68
53
79
50
表10-9试验组回收率（%）
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
大肠埃希菌
73
85
74
73
85
表10-10稀释剂对照组菌落计数（cfu）
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
大肠埃希菌
1
75
75
65
86
49
2
59
65
53
68
45
平均
67
70
59
77
47
表10-11稀释剂对照组回收率（%）
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
大肠埃希菌
平均
74
88
82
71
80
（9）结论:
常规法验证试验结果显示，试验组和稀释剂组各菌回收率均大于70%。
该法专属性良好，可用于本品微生物限度的检验。
3.4.2中试产品检查：
取本品三批，依法检查（《中国药典》2005年版二部附录XIJ），结果见表10-12。
表10-12卡莫氟软胶囊微生物限度检查结果
批号
060501
0605102
060503
微生物限度
符合规定
符合规定
符合规定
本品三批微生物限度检查结果均符合规定，将其列入质量标准。
3.5有关物质
参照《中国药典》2005版二部卡莫氟有关物质检查。
3.5.1方法：
取本品内容物适量（约相当于卡莫氟200mg），加甲醇－冰醋酸（99：
1）制成每1ml含20mg的溶液，振摇10分钟，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加甲醇－冰醋酸（99：
1）制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（中国药典2005年版二部附录VB）试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯－丙酮（5:
3）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。
供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深（小于0.5%）。
3.5.2方法的建立
（1）专属性试验
1、分别称取卡莫氟原料药、空白辅料适量，加甲醇－冰醋酸（99：
1）制成每1ml中含20mg的溶液，照薄层色谱法（《中国药典》2005年版二部附录VB）试验，吸取上述溶液各15μl，依法检测，有关图谱见附图。
检测结果可知空白辅料不干扰本品有关物质测定。
2、酸、碱水解和氧化加速破坏试验
取卡莫氟0.6g，加甲醇15ml溶解后分作三份，分别加盐酸（1mol/L）1ml，加氢氧化钠溶液（1mol/L）1ml，加10％双氧水1ml,室温放置10小时，加甲醇－冰醋酸（99：
1）制成每1ml约含卡莫氟20mg的溶液，依法测定，破坏试验的TLC图谱见附图。
试验结果表明，卡莫氟经酸破坏试验影响不大；碱、氧化破坏后，有杂质产生，且与主斑点分离良好。
本薄层色谱条件能够检出本品的降解产物，且分离度符合要求。
（2）检测限试验
取卡莫氟原料药适量，加甲醇－冰醋酸（99：
1）逐渐稀释，依法检查，结果见附图，结果显示本法可检出1.5μg的卡莫氟，表明本法有较高灵敏度。
6含量测定
6.1卡莫氟含量测定
6.1.1方法依据
卡莫氟片质量标准（中国药典2005年版二部“卡莫氟片”）含量测定采用分光光度法。
本品为卡莫氟软胶囊，主要辅料为大豆油，大豆油在258nm波长下有吸收，对卡莫氟含量测定有干扰。
并且卡莫氟的主要降解产物氟尿嘧啶在该波长下也有吸收，采用分光光度法测定本品含量造成结果偏高，因此原方法不适合卡莫氟软胶囊中卡莫氟含量的测定。
我公司参考有关文献“高效液相色谱法测定嘧福禄片中卡莫氟的含量及其有关物质”中含量测定的方法，采用高效液相色谱法,能将供试品中的主峰与杂质峰完全分离，方法简便、准确。
6.1.2色谱条件的确定
1、流动相选择
照文献方法采用的流动相：
甲醇-混合酸溶液（磷酸6.77mL，冰醋酸5.72mL，硼酸6.18g以水稀释至1000mL，用2mol/L氢氧化钠调节pH至2.0）（85：
15），有很好的准确度及分离度。
考虑使用试剂多、操作繁琐。
故选择甲醇－水—磷酸（85：
15：
0.1）为流动相。
2、检测波长的选择
照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣA），取卡莫氟原料药适量，加流动相溶解，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液制成每1ml中含卡莫氟10μg的溶液，在210～400nm的波长范围扫描，结果见附图。
由图看出本品在258nm处有最大吸收。
故选择258nm作为本品含量测定检测波长。
3、色谱条件：
仪器：
LC-10AT液相色谱仪 LC-10ATvp泵，SPD-10A紫外检测器。
色谱柱：
依利特ODS2C18柱，5μm，4.6mm×150mm。
流动相：
甲醇-水-磷酸（85：
15：
0.1）
检测波长：
258nm
流速：
0.8ml/min
6.1.3线性关系试验
精密称取卡莫氟对照品7.8mg，置50ml量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置20ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取上述溶液各10μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，按峰面积计算回归方程，结果见表10-14，以浓度为横座标，峰面积为纵座标，绘制线性关系曲线图。
表10-14浓度与峰面积的线性关系试验结果
浓度（μg/ml）
7.8
15.6
23.4
31.2
46.8
峰面积
130135
258793
378462
508212
764595
图10-3含量测定线性关系曲线图
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标得回归方程：
A=16241C+2656.8
r=0.9999
上述线性试验结果表明，本品进样浓度在7.8～46.8μg/ml范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。
6.1.4回收率试验
精密称取卡莫氟约12mg、15mg及18mg各三份，精密称定，分别置50ml量瓶中，分别入处方量的辅料，加流动相30ml，振摇，加流动相稀释至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液加流动相稀释制成分别含卡莫氟80%、100%、120%、（处方量）三种不同浓度的溶液，各三份，各取5.0ml分别置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取卡莫氟对照品适量，用流动相溶解稀释并制成每1ml中约含30μg的溶液，作为对照品溶液。
取上述各溶液各10μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，计算回收率，结果见表10-15。
表10-15卡莫氟含量测定回收率试验结果
浓度
加入量（mg）
峰面积
测得量（mg）
回收率（%）
总回收率（%）
RSD（%）
80%
13.62
456903
13.60
99.88
99.84
0.59
13.51
452096
13.46
99.63
13.56
453890
13.51
99.66
100%
16.73
564909
16.82
100.53
16.45
555912
16.55
100.61
16.69
564038
16.79
100.62
120%
20.42
679084
20.22
99.01
20.32
676288
20.13
99.09
20.31
679075
20.22
99.55
由表10-15可见，在上述三种浓度下，卡莫氟总回收率分别为99.84%，表明空白辅料对其含量测定无干扰，测定结果准确。
上述试验结果表明，本方法回收率良好。
6.1.5溶液稳定性试验
取处方量卡莫氟原料及辅料适量，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相适量，振摇，加流动相稀释至刻度，以0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液加流动相稀释至每1ml中约含卡莫氟30μg的溶液，作为供试品溶液，分别于0、2、4、8小时取样测定，结果见表10-16。
表10-16溶液稳定性试验结果
时间（小时）
峰面积
平均值
RSD（%）
0
537368
533488
0.96
1
529338
2
537784
4
525502
8
537449
试验结果表明：
本品溶液在放置8小时后测定，峰面积基本无变化，表明溶液在8小时内稳定。
6.1.6精密度试验
取线性关系项下的第3份溶液，按上述色谱条件，量取10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，结果见表10-17。
表10-17精密度试验结果（n=6）
测定次数
峰面积
平均
RSD（%）
1
513055
511470
0.66
2
506243
3
507482
4
515189
5
512848
6
514002
精密度试验结果RSD%（n=6）为0.66，表明本法精密度良好。
6.1.7卡莫氟含量测定方法的确定
照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录ⅤD）测定。
色谱条件及系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇－水—磷酸（85：
15：
0.1）为流动相；检测波长为258nm,流速0.8ml/min。
理论塔板数按卡莫氟峰计算应不低于2000；卡莫氟与各杂质峰的分离度应符合规定。
测定法取本品约0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相适量，振摇，加流动相稀释至刻度，以0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液加流动相稀释制成每1ml中约含卡莫氟30μg的溶液作为供试品溶液；另取卡莫氟对照品约15mg，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含30μg的溶液，作为对照品溶液。
分别取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图按外标法以峰面积计算，即得。
6.1.8试制样品的含量测定
取试制样品（批号为：
060501、060502、060503），按上述方法测定含量，结果见表10-18，图谱见附图。
表10-18试制样品的含量测定结果
批号
含量（%）
060501
100.4
060502
99.46
060503
99.50
结果表明：
本品三批含量测定结果均在质量标准范围内。
6.2含量限度的确定：
参考卡莫氟片的标准，根据本品的样品测定结果，制定本品的含量限度：
含卡莫氟（C11H16FN3O3）应为标示量的90.0％～110.0％。
资料10图谱目录
附图10-1卡莫氟软胶囊溶出度试验波长选择UV光谱图
附图10-2卡莫氟软胶囊有关物质检查专属性试验TLC图
附图10-3卡莫氟软胶囊有关物质检查检测限试验TLC图
附图10-4卡莫氟软胶囊3批中试样品（060501，60502，060503）有关物质检查TLC图
附图10-5卡莫氟软胶囊含量测定波长选择UV光谱图
附图10-6卡莫氟软胶囊含量测定系统适应性HPLC图
附图10-7卡莫氟软胶囊含量测定图谱含量测定空白溶剂HPLC图
附图10-8卡莫氟软胶囊含量测定空白辅料HPLC图
附图10-9卡莫氟软胶囊含量测定线性范围试验HPLC图
附图10-10卡莫氟软胶囊含量测定回收率试验HPLC图
附图10-11卡莫氟软胶囊含量测定溶液稳定性试验HPLC图
附图10-12卡莫氟软胶囊含量测定精密度试验HPLC图
附图10-13卡莫氟软胶囊3批中试样品（060501，60502，060503）含量测定HPLC图
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