注射用水纯化水检验规程.docx
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注射用水纯化水检验规程
上海普济医疗器械制造有限公司
注射用水（纯化水）
检验指导书
文件编号:
PJ/JG-001
版本：
B
修改状态：
0
受控状态：
发布日期：
实施日期：
编写:
校对:
核准:
1、引用标准
中华人民共和国药典2010年版、GB14233.2-2005、GB14233.1-2008
2、检测仪器
a）恒温水浴锅：
b）干烤箱:
c）恒温培养箱：
d）电子天平：
e）PH计：
f）霉菌培养箱：
3、检查要求及检测规程
3.1性状
取适量本品，置试管中，目视观察应为无色澄明液体，无臭、无味。
3.2酸碱度测定
3.2.1纯化水:
取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色，另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。
3.2.2注射用水:
取本品100mL,加饱和氯化钾溶液0.3mL,按PJ/SG026-0111/0《pHS-3C型酸碱度计操作规程》测定供试溶液的PH值，记录检测结果。
正常范围应为5.0~7.0。
3.3硝酸盐
1）取30mL试管两只。
其中1支加本品5ml，作为测定管；另1支中加标准硝酸盐溶液0.3mL，加无硝酸盐的水4.7mL，作为标准管。
2）置两管于冰水浴中冷却，向两试管中各加入10%氯化钾溶液0.4mL与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1mL，摇匀。
缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将两支试管于50℃水浴中放置15分钟。
3）比较两管的颜色，样品管不得比标准管更深。
（0.000006%）。
3.4亚硝酸盐
1）取30mL试管两只，其中一管加入本品10mL，作为测定管；另一管加入标准亚硝酸盐溶液0.2mL，加无亚硝酸盐的水9.8mL，作为标准管。
2）向两管中都加入对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）1mL与盐酸萘乙二胺溶液（0.1→100）1mL。
3）比较两管的颜色，样品管不得比标准管更深。
（0.000002%）
3.5氨
3.5.1纯化水
1）取两支50ml纳氏管，其中一管加入50ml本品，作为测定管；另一管加氯化氨溶液（浓度31.5μg/ml）1.5ml，加无氨水48ml，作为标准管。
2）向两管中加入碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟。
3）比较两管颜色，测定管不得比标准管更深（0.00003%）。
1.1注射用水氨检验：
1）取两支50ml纳氏管，其中一管加入50ml本品，作为测定管；另一管加氯化氨溶液（浓度31.5μg/ml）1.0ml，加无氨水48ml，作为标准管。
2）向两管中加入碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟。
3）比较两管颜色，测定管不得比标准管更深（0.00002%）。
4二氧化碳
1）取本品25ml，置50ml具塞量筒中，加氢氧化钙试液25ml。
2）密封振摇，放置1小时内不得发生浑浊。
5易氧化物
1）取本品100ml，置250ml三角烧瓶中，加稀硫酸10ml，置电炉上煮沸。
2）煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.1ml，再煮10分钟。
目视观察，粉红色不得完全消失。
6重金属
1）取两支100ml纳氏管，其中一管加入50ml本品，作为测定管；另一管加入标准铅溶液1.5ml，作为标准管。
2）向两管中各加水18.5ml，蒸发至20ml，放冷，加醋酸盐缓冲液（PH3.5）2ml与水适量至25ml，加硫代乙酰胺试液2ml，摇均，放置2分钟。
3）比较两管的颜色，测定管不比标准管更深。
（0.00003%）
7不挥发物
1）把100ml蒸发皿放入烘箱中，调节温度为105℃，两小时后取出迅速放入干燥器中，冷却后称重。
再放入烘箱中，调节温度为105℃，一小时后取出迅速放入干燥器中，冷却后称重。
一直到恒重（即连续两次称量的差值小于0.3mg）。
2）取100ml本品于蒸发皿中，在水浴上蒸干。
3）置蒸干后的蒸发皿于烘箱中，按照121）的方法操作，干燥至恒重。
4）计录检测结果，计算遗留残渣的质量，不得超过1mg。
8细菌内毒素（注射用水）
测试方法按生物测试检验规程PJ/JG-002。
每毫升内毒素应小于0.25EU。
9微生物限度
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7
7.1注射用水：
1）取样口经75%酒精消毒，排放约1分钟，用无菌接收瓶按无菌操作方法取水样500ml左右。
分别取200ml注射用水，用0.45μm的滤膜过滤，用无菌镊子夹取滤膜，分别将滤膜放于经检查无菌的营养琼脂、及玫瑰红钠琼脂培养平板上，倒置，细菌于30℃~35℃培养48小时，霉菌及酵母菌培养置20~25℃恒温培养箱中，培养72小时。
计算每100ml注射用水菌落数。
同时用培养基做2个空白平板作为阴性对照。
2）注射用水细菌、霉菌和酵母菌总数每100ml不得超过10个。
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14.1
14.2纯化水
1）取1ml纯化水，按14.11）方法操作。
2）纯化水细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得超过100个。
10取样批及取样量
取样批：
每周检测一次取样量:
1500ml
细菌、霉菌及酵母菌计数
计数方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种
验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃稀菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501）]
白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用
0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。
验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
1）试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
2）菌液组测定所加的试验菌数。
供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
3）稀释剂对照组若供试验制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。
若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法，离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1﹕10、1﹕102、1﹕103等稀释级。
1、平皿法
采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。
取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5~7天进行菌落计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基用于酵母菌计数。
在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。
然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
含蜜蜂、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。
菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌数在30~300之间、霉菌平均菌数在30~300之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
（2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。
若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值不大于2但不超过5时,以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌数等于异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
（3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
（4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落数生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2、薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。
选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。
油性供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充公干燥。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。
每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免率膜上的微生物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。
若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml过滤。
用pH7.0无菌氯化钠冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。
冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红琼脂培养基或酵母浸出粉冻葡萄糖琼脂培养基平板上培养。
每种培养基至少制备一张滤膜。
3、阴性对照试验
取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。
阴性对照不得有菌生长。
4、培养及计数
培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。
5、菌数报告规则
以相当于1ml或100ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌落数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。
注射用水（纯化水）微生物测试方法验证
1.检测方法：
2.目的：
得出校正因子，提高今后检测的准确性。
3.实验材料
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2
3
3.1枯草杆菌菌片，白色念株球菌、无菌无热原生理盐水、胰酪大豆琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基。
3.2压力蒸汽消毒器、超净工作台，9cm平皿、具塞烧瓶、玻璃珠、剪刀、棉签、吸管、注射器（均匀菌）。
3.3注射用水级纯化水。
4.菌液制备
1
2
3
4
4.1菌片1×106cfu/片，放入无菌具塞烧瓶中，加入少量无菌玻璃珠，加100ml无菌、无热原0.9%生理盐水，上盖摇动，使菌片破碎，得1×104个/ml悬浮液；
4.2取4.1条制备的菌液10ml于三角烧瓶中，加0.9%生理盐水至200ml，得5×102个/ml菌悬浮液，吸0.2ml于平板内，倒入培养基，摇匀，作菌落计数，同时做2个平行；
4.3分别取4.2条菌液0.2ml于薄膜上，菌面朝上贴于营养基平板上培养。
细菌培养35℃恒温培养箱中，培养48小时。
进行菌落计数。
各平行2个。
4.4接种白色念珠球菌的新鲜培养物至改良马丁培养中，培养24~48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
4.5分别取4.4条菌液1ml于薄膜上，菌面朝上贴于玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。
置20~25℃恒温培养箱中，培养72小时。
进行菌落计数。
各平行2个。
5.结论
平皿菌落数×稀释倍数=测试总菌落数
实际总菌数/测试总菌落数=校正因子
注：
两种方法的校正因子分别计算
种类
样品编号
注射用水
细菌1
细菌2
霉菌及酵母菌1
霉菌及酵母菌2
1
90
80
130
90
85
110
2
120
90
120
110
110
115
平均
98
113
实际总菌数：
（130+140）/2=135
1、注射用水细菌校正因子：
135/98=1.38
2、注射用水霉菌及酵母菌校正因子：
135/113=1.19
种类
样品编号
纯化水
细菌1
细菌2
霉菌及酵母菌1
霉菌及酵母菌2
1
90
110
80
120
100
100
2
130
90
130
80
110
105
平均
105
103
实际总菌数：
（130+140）/2=135
1、纯化水细菌校正因子：
135/105=1.29
2、纯化水霉菌及酵母菌校正因子：
135/103=1.31
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