生命科学领域十大创新产品公布.docx

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生命科学领域十大创新产品公布

2010年生命科学领域十大创新产品公布

《科学家》网站日前评选出了2010年度生命科学领域的十大创新产品。

美国西北大学分子化学家NeilKelleher、普林斯顿大学基因组研究学者AmyCaudy、西北太平洋国家实验室生物学家H.StevenWiley以及454LifeSciences的创始人JonathanRothberg受邀担任评委，从参评的60多种产品中选出前10名，作为今年生命科学领域的十大创新产品，它们分别是：

第一名：

PacBioRS第三代基因测序系统

众所周知，天然的DNA复制本身就是一个非常高效且准确的过程。

真核生物DNA复制的速度达几十个核苷酸/秒。

若能以这样的神速测序，那可比Sanger测序快了几万倍。

然而，知易行难。

如何在不影响聚合酶活性的前提下实时观察DNA合成，这可是个棘手的问题。

要知道，DNA聚合酶的直径只有15nm。

而且，这是一个涉及酶学、表面化学和检测光学的多学科难题。

早在10多年前，美国康奈尔大学的研究生StevenTurner和JonasKorlach就开始为解决这一难题而做出不断努力。

如今，Korlach和Turner创办了一家名为PacificBiosciences（以下简称PacBio）的公司，并且终于将他们的想法转变成为现实产品。

让我们看看他们主要克服了哪些挑战。

实时观察DNA聚合酶的主要挑战之一是如何能在DNA合成期间检测到单个核苷酸的掺入。

因为在显微镜实时记录DNA链上荧光的时候，周围众多的荧光标记的核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

正在他们一筹莫展之际，突然，微波炉门给了他们启发。

微波炉门上的金属筛布满了小洞，它们比微波的波长要小得多。

因此，这些洞能阻止微波通过并穿透玻璃。

然而，比波长更小的可见光就能够通过，让我们看到食物。

他们的SMRT技术应用了相同的原理，不过规格就缩小至纳米级，称之为ZMW（zero-modewaveguide，零模式波导）。

ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，它阻止可见的激光（波长大约为600nm）完全透过ZMW。

激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30nm被照亮（下图）。

在每个ZMW中，单个DNA聚合酶分子利用专利技术锚定在底部玻璃的表面。

随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。

当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。

这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。

因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。

测序是在专利的SMRTCell中开展的，每个Cell中有一个阵列，上面大约有75,000个ZMW。

每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条不同的DNA样品链。

这样，SMRTCell能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。

Korlach与Turner还有一项重大发明。

传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。

这对于实时观察DNA合成也是有问题的，因为大分子的染料会干扰DNA聚合酶的活性，或造成聚合反应提前终止。

因此，Korlach和Turner就开发出一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行标记，而不是碱基，这样，一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，标记基团就会自动脱落。

当然，要将ZMW中的反应记录下来，还需要一台高精尖的仪器。

PacBioRS于是诞生了，它能够实时开展、监控并分析单分子生化反应。

PacBioRS使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集荧光所发射的光脉冲，观察整个过程；并使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT碱基。

一旦测序开始，实时的数据就传送到初步分析流水线，生成碱基身份和质量值。

以上三种新技术结合，就能让研究人员在短短的几分钟内对长片段DNA进行测序。

它的速度、读长、灵活性和费用让其从第三代测序中脱颖而出。

从样本制备到测序，所需的时间还不到一天。

典型的测序运行时间低至30分钟。

序列数据在几分钟之内就能产生，而不是几天，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。

PacBioRS目前的读长超过1kb，比第二代测序要长得多。

此外，试剂消耗和样本制备极少，不需要常规的PCR扩增，失误也大大减少，聚合酶动力学的直接观察赋予了测序之外的更多应用。

凭借这些优势，PacBio今年被美国麻省理工学院（MIT）的《技术评论》（TechnologyReview）杂志评为全球50家最具创新力的企业之一。

一系列的文章也证明了SMRT技术。

Korlach与Turner于2009年2月在《科学》杂志上发表了一篇介绍PacBio单分子DNA测序技术的文章。

这篇文章代表了首个第三代测序技术的“原理验证”，因此引用率非常高。

而后，他们又利用SMRT技术，直接测定了DNA的甲基化，这相对目前流行的第二代测序技术又前进了一大步。

文章发表在今年5月的《NatureMethods》上。

荧光脉冲的到达时间和持续时间反映了有关聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

各种修饰对聚合酶动力学的影响不一，从而能够将它们区分开。

研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circularconsensussequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰（mA、mC和hmC）。

研究人员还预计，其它的表观遗传学修饰，以及各种形式的DNA伤害，也能用这种方法检测。

看到这里，大家可能迫不及待地想知道PacBio的测序仪何时上市，价格多少。

其实，PacBioRS已成型，目前正在早期试用阶段。

今年2月份，PacBio宣布了10位北美的早期试用客户，包括贝勒医学院、冷泉港实验室、美国能源部联合基因组研究所、华盛顿大学基因组中心和斯坦福大学等等，并与第二季度开始发货。

8月份，PacBio又迎来了它的首位欧洲试用客户，大名鼎鼎的WellcomeTrustSanger研究院。

整个测序系统包括PacBioRS仪器以及专利的耗材。

PacBioRS在美国的目录价为695,000美元。

耗材部分则包括SMRTCell和试剂盒。

PacBioRS上的每个反应消耗一个SMRTCell。

8个SMRTCell包装成8Pac的形式。

单个SMRTCell在美国的售价大约为99美元，8Pac的包装则低于800美元。

另外，他们还提供了三种试剂盒，用途各不同。

TemplatePreparationKit将DNA转化成SMRTbell文库形式。

BindingKit则将这个文库与聚合酶结合，为测序做准备。

SequencingKit包含了实时测序所需的试剂。

每个样本可在单个SMRTCell上测序，也可根据项目需求在多个SMRTCell中测序。

因此，每个反应的价格取决于实验设计。

PacBio预计，到2013年，个人基因组的测序能在15分钟内完成，费用低于1000美元，人人都可以消费得起。

说实话，2008年我第一次听到这个消息时，心中饱存疑惑，看来我实在是低估了PacBio的实力，也低估了测序技术发展的脚步。

（

Thelongawaited“third-generation”sequencerfromPacificBiosciencestakesfirstplaceinthisyear’sTop10Innovationscontest.Thetechnologyqualifiesasbelongingtoanewerabecauseit’s“thefirstsingle-moleculereal-timesequencer,”saysStephenTurner,themachine’scoinventorandthecompany’schieftechnologyofficer,speakingtoapackedauditoriumatthisyear’sAmericanSocietyofHumanGeneticsmeeting.Likeothersingle-moleculesequencingmachines,thePacBioRSreadsaburstoffluorescentcolorasataggednucleotideisincorporatedintoasinglemoleculeofDNA.However,whatdifferentiatesthistechnologyfromothersisthattheanchoredDNApolymeraseprocessesnucleotidebindinginrealtime.Mostsecond-generationtechnologieswasheachtypeofnucleotideoverthepolymeraseoneatatime,simplifyingdetection,butslowingtheprocess.ThePacBioRSeliminatestheneedformultiplewashingsbyanchoringasingleDNApolymeraseatthebottomofachamber.Thelabelednucleotidesdiffusefreelyintothewell,wheretheyareexcitedbyalaserandtheirfluorescenceisdetectedbyopticsonthetransparentundersideofthechamber.Becausethelaserlightemitsawavelengthofabout600nm,itcan’tpenetratefartherthanthebottompartofthe70-nm-widewell,keepinglabelednucleotidesoutsideofthewellinthedark,andthusgreatlyreducingbackgroundsignal.Thesurprisingadvantageofreal-timesequencingisthatthemachinecandetectanaturalstallingwhen,forexample,theDNApolymeraseencountersamethylatedorotherwisemodifiedbase.Theamountoftimethepolymerasestallscanbeusedtocalculatedifferentepigeneticmodifications,addinganewlayerofinformationtothesequencingdata.Theinstrumentcosts$695,000;consumablesandsequencingkitsaresoldseparately.

第二名：

可用来定制细胞株的CompoZr™锌指核酸酶技术

Sigma-AldrichcrackedtheupperreachesofourinauguralTop10Innovationslistin2008,snaggingthirdplacewithitsCompoZrcustomzinc-fingernucleaseservice.Eversincethen,theplatformhasborneseriousfruit.Lastyear,Sigma-Aldrich’sknockoutrat,madeusingCompoZr,tookfifthplace.Thisyear,thecompanyscoressilverwiththenextstepinrealizingthepotentialofzinc-fingertechnology:

custom-madecelllines.“Thisyearit’sallaboutcellsandcellbiology,”saysDaveSmoller,presidentofSigma’sresearchbiotechbusinessunit.Sigmafirstofferedthedesign-your-own-cell-lineservicetobiopharmaceuticalcompaniesinFebruary,accordingtoSupriyaShivakumar,thecompany’sglobalcommercialmarketingmanager.“It’sveryinterestingwhatcustomersarebringingtousandhavingusmakeforthem,becauseit’sbeyondevenwhatwehadthoughtof,”Shivakumarsays,addingthatcompanieshaverequestedmore-efficientengineeredcellscapableofpumpingoutspecifictherapeuticproteinsandcustomcellsthatmimicaparticularhumandisease.“We’vemadeeverythingfromsimpletolargedeletions;we’veinsertedbigchunksoffluorescentproteingenes,andevenmadesingle-nucleotidechanges.”

ThoughSmollerwon’tsayhowmanycustomordershavebeenfilled,henotesthatthepricevariesfrom“northof$40,000to$50,000allthewayupto$100,000”foracustom-madecellline,dependingonthegeneticmanipulationsrequested.InNovember,Sigmabeganshippingoff-the-shelfcelllines—startingwithhumanosteosarcomacellscontainingfluorescently-taggedorganellemarkerproteins—createdusingCompoZr,andsellingforapproximately$6,000apop,accordingtoSmoller.Sigmaisbettingthattheease,convenience,andprecisionoftheirservicewillattractmorebusinessasitexpands.“There’salotofdemandforhavingsomethingthat’sguaranteed,everythingisdoneforyou,andeverythingyouwantedisdeliveredtoyourdoor,”Shivakumarsays

第三名：

Scepter手持式细胞计数器

Scepter—手持式细胞计数器依据电阻抗原理，以其小巧的移液枪式设计，让操作者只需轻轻一按，细胞就可被自动吸入计数，结果以图形的形式显示细胞的直径和体积，提供细胞密度和细胞群分布数据，为掌控细胞健康状况提供了便捷的量化手段，整个过程只需14秒。

测量的数据不仅可直接存于手持式计数器内，也可以Excel形式导出，为数据处理提供方便。

Forgetthedaysofsquintingatslideswithaclickerinhand,oroperatingbulkybenchtopmachinestodeterminethenumberofcellsinyoursample.Cellcountingisnowportable,usingthenewScepterHandheldAutomatedCellCounterfromEMDMillipore.“Ittakesthetediumaway,”saysGraceJohnston,productmanagerforScepter.IntroducedinMarch2010,theEMDMilliporeScepter—currentlytheonlyhandheldautomatedcellcounteravailable—soldover1,000unitsinitsfirstsixmonthsonthemarket.TheScepterhandleslikeapipetteandisequippedwithascreenthatdisplaysinstructionstoguidetheuserthroughtheprocess.“Alotofscientistsgetnervousaboutadaptingtoanautomatedinstrument,butit’sreallystraightforwardandeasytouse,”saysJohnston.Insteadofrelyingonobjectrecognitionsoftwarelikesomeautomatedbenchtopcounters,theScepterdrawssamplesintoadisposablesensorwheretheypassthroughanopeningchargedwithacurrent.Ascellsdisruptthecurrent,theScepterrecordseachchangeinvoltage.Withinseconds—14,onaverage—thescreendisplayscellconcentration,averagecelldiameter,andaveragecellvolume,aswellashistogramsofeachdistribution.“Youcanhaveaccurateandreliablecellcountsfromonesampletothenext,andallofthatcanbedonerightattheculturehoodwithin30seconds,”saysJohnston.Atalistpriceof$2,995,it’salsothemostinexpensiveautomatedcellcounteronthemarket,sheadds.

第四名：

RapidTip快速PCR产物纯化吸头

美国DiffinityGenomics公司的RapidTip快速PCR产物纯化吸头采用了创新的技术，在标准规格的移液器吸头中加入了专利的吸附材料。

对于100bp—10Kb范围的纯DNA片段的回收率高于90％；同时可有效去除PCR反应中的杂质，包括核苷酸、引物和引物二聚体。

纯化过程仅仅需要一个步骤，耗费仅一分钟！

极大地减少了在下游应用中用于纯化和准备PCR反应所需的时间。

TheDiffinityRapidTipisaone-steppipettetipforuseinDNApurification.Followingapolymerasechainreaction（PCR）,samplescontainmorethanjusttheDNAofinterest.Theyalsocontainnucleotides,primers,andotherimpuritiesthatmustberemoved.TraditionaltechniquesforpurifyingtheDNAinvolveseveralstepsofwashing,buffering,andrinsingthatcantakeupto30minutesorlonger.WiththeDiffinityRapidTip,allthosestepsarecombinedintoasingle,normal-lookingpipettetip.Theproductisextremelyeasytouse,saysthecompany’sCEOandpresidentJeffHelfer.“Put[thetip]onthepipettor,aspirate,anddispense.It’sthatsimple.”Theprocessrequires10–12repetitionsofpullingupandreleasingthesolution,andtakesaboutoneminute,makingitabout50timesfasterthantraditionalpost-PCRpurificationtechniques,Helfersays.ThecompanyplanstoreleaseanewerversionoftheRapidTipinJanuary,onethatwouldrequireonlytwoorthreerepetitioncycles,makingitevenmoreefficient.“Youstartandendthe[purification]processwiththeverysamedisposablepipettetip,”Helfersays.“It’sgreen,muchlessexpensive,andatt