扫描电镜与透射电镜样品制作完全版资料.docx
《扫描电镜与透射电镜样品制作完全版资料.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《扫描电镜与透射电镜样品制作完全版资料.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
扫描电镜与透射电镜样品制作完全版资料
相关仪器的信息：
透射电镜：
JEOL（公司）JEM-1230（型号）TEM，产地：
日本
超薄切片机：
Reichert-JungUltracutEultramicrotome，产地：
奥地利
扫描电镜：
PhilipsXL30ESEM，产地：
捷克
临界点干燥仪：
HitachiHCP-2Criticalpointdryer，产地：
日本
真空喷镀仪：
Eiko IB5 ioncoater，产地：
日本
包埋剂：
SPI-CHEMSpurrresin，产地：
USA
TEM样品包埋块制作有关注意事项
一、取材：
1、动作迅速：
组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；
2、减少损伤：
选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；
3、组织块大小：
一般要小于1mm3。
二、固定：
固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞
的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。
固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中
2、使用锇酸的注意事项
I通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗：
应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水：
脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意：
I逐级脱水而不能急剧脱水；
II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；
III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在
4℃保存。
五、渗透：
渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外
空隙被包埋剂所填充。
包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。
包埋剂配制及使用过程中的注意事项：
I所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；
II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；
III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。
剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。
表1戊二醛溶液的配制
终浓度
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
5.0
0.2MPBS/ml
50
50
50
50
50
50
50
25%戊二醛水溶液/ml
4
6
8
10
12
16
20
重蒸水加至/ml
100
100
100
100
100
100
100
表20.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制
A液：
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液
B液：
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液
Na2HPO428.4g
或Na2HPO4.H2O31.61g
或Na2HPO4.2H2O35.6g
或Na2HPO4.7H2O53.63g
或Na2HPO4.12H2O71.64g
加双蒸水至1000mL
NaH2PO424.0g
或NaH2PO4.H2O27.6g
或NaH2PO4.2H2O31.21g
加双蒸水至1000mL
按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方
pH值
5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0
A液
§8-2购物环境与消费行为2004年3月20日8.012.318.526.537.549.061.072.081.087.091.594.7
B液
据调查统计，有近94%的人喜欢亲戚朋友送给自己一件手工艺品。
无论是送人，个人兴趣，装饰还是想学手艺，DIY手工制作都能满足你的需求。
下表反映了同学们购买手工艺制品的目的。
如图（1-4）92.087.781.673.562.551.039.028.019.013.08.505.30
在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。
2、价格“适中化”表3多聚甲醛-戊二醛固定液的配制
溶液名称
剂量
10%多聚甲醛溶液
1．www。
cer。
net/artide/2004021313098897。
shtml。
20ml
0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液
50ml
１９９６年“碧芝自制饰品店”在迪美购物中心开张，这里地理位置十分优越，交通四通八达，由于位于市中心，汇集了来自各地的游客和时尚人群，不用担心客流量的问题。
迪美有３００多家商铺，不包括柜台，现在这个商铺的位置还是比较合适的，位于中心地带，左边出口的自动扶梯直接通向地面，从正对着的旋转式楼梯阶而上就是人民广场中央，周边４、５条地下通道都交汇于此，从自家店铺门口经过的９０％的顾客会因为好奇而进去看一下。
25%戊二醛水溶液
随科技的迅速发展，人们的生活日益趋向便捷、快速，方便，对于我国传统的手工艺制作，也很少有人问津，因此，我组想借此创业机会，在校园内开个DIY创意小屋。
它包括编织、刺绣、串珠等，让我们传统的手工制作也能走进大学，丰富我们的生活。
10ml
“漂亮女生”号称全国连锁店，相信他们有统一的进货渠道。
店内到处贴着“10元以下任选”，价格便宜到令人心动。
但是转念一想，发夹2.8元，发圈4.8元，皮夹子9.8元，好像和平日讨价还价杀来的心理价位也差不多，只不过把一只20元的发夹还到5元实在辛苦，现在明码标价倒也省心省力。
重蒸水
20ml
表42%锇酸溶液的配制
据调查统计在对大学生进行店铺经营风格所考虑的因素问题调查中，发现有50%人选择了价格便宜些，有28%人选择服务热情些，有30%人选择店面装潢有个性，只有14%人选择新颖多样。
如图（1-5）所示试剂
用量
锇酸/g
4、如果学校开设一家DIY手工艺制品店，你是否会经常去光顾？
1
据统计，上海国民经济持续快速增长。
03全年就实现国内生产总值（GDP）6250.81亿元，按可比价格计算，比上年增长11.8%。
第三产业的增速受非典影响而有所减缓，全年实现增加值3027.11亿元，增长8%，增幅比上年下降2个百分点。
重蒸水/ml
50
表5Spurr包埋剂配方
药品名称
硬配方
软配方
我们现用的配方
VCD树脂
10g
10g
10g
DER736
6g
7g
8g
NSA
26g
26g
26g
DMAE
0.4g
0.4g
0.4g
注：
通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。
DMAE的用量则调节聚
合反应的速度。
透射电镜样品制备程序：
No.1包埋切片样品的制作过程
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
✧用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；
✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
✧用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。
✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；
✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；
✧纯包埋剂处理样品过夜；
将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。
样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。
1）.Doublefixation:
Thespecimenwasfirstfixedwith2.5%glutaraldehydeinphosphatebuffer（pH7.0）formorethan4hours;washedthreetimesinthephosphatebuffer,oncefor15min;thenpostfixedwith1%OsO4inphosphatebuffer（pH7.0）for1hourandwashedthreetimesinthephosphatebuffer.
2）.Dehydration:
Thespecimenwasfirstdehydratedbyagradedseriesofethanol（50%,70%,80%,90%,95%and100%）forabout15to20minutesateachstep,transferredtoabsoluteacetonefor20minutes.
3）.Infiltration:
Thespecimenwasplacedin1:
1mixtureofabsoluteacetoneandthefinalSpurrresinmixturefor1houratroomtemperature,thentransferredto1:
3mixtureofabsoluteacetoneandthefinalresinmixturefor3hoursandtofinalSpurrresinmixtureforovernight.
4）.Embeddingandultrathinsectioning:
Specimenwasplacedincapsulescontainedembeddingmediumandheatedat70℃forabout9hours.Thespecimensectionswerestainedbyuranylacetateandalkalineleadcitratefor15minutesrespectivelyandobservedinTEMofModelJEM-1230.
No.2负染样品的制作（以细菌为例）
Negativestainingofbacterium
Thebacteriumsuspensionwasstainedby1to2%solutionofphosphotungsticacid（PTA，磷钨酸）inapHrangeof6.5to7.0for15to30seconds.Then,thebacteriumwasobservedinTEMofModelJEM1230.
扫描电镜样品制备方法
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；"
用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；"
倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；"
用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20"min。
用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。
"
临界点干燥。
"
镀膜，观察。
"
处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30ESEM型环境扫描电镜中观察。
Spurr低粘度包埋剂
ERL-42062.5g
NSA6.5g
DER-7362.0g
DMAE0.1g
前三种试剂混合均匀后，加入DMAE，充分混合。
按每个样品2.5g的用量配制。
70℃聚合8h以上。
干脆把透射电镜样品的制备方法一起发了：
透射电镜样品制备方法
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；"
用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；"
倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；"
用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。
"
用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；"
用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；"
纯包埋剂处理样品过夜；"
将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。
样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在***JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察
SEM需前处理样品制备过程中的注意事项
I取材：
1cm3左右即可，不需要象TEM样品那么小；
II脱水：
样品较大，脱水时间可适当延长；
III临界点干燥：
一般采用液体二氧化碳为置换液，二氧化碳与乙醇或丙酮互溶性较差，而与醋酸异戊酯互溶液性较好。
因此，样品脱水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡，以便置换存留于组织中的脱水剂。
注意：
醋酸异戊酯挥发性较强，应在通风橱中操作，废液用密闭容器装好后丢弃。
IV金属喷镀：
新鲜样品自身就可导电，而经过干燥的生物样品不能导电。
这种不导电的样品在SEM中观察时，会产生电荷积累而影响观察稳定性。
使样品导电的方法通常是在样品表面喷一层厚度约100埃的金膜。
No.1直接观察的扫描电镜样品
I样品粘附在样品台上，在EikoIB5型离子溅射仪中喷镀4-5min。
II样品在荷兰Philips公司的XL30型ESEM（环境扫描电镜）中观察。
The specimenwascoatedwithgold-palladiuminEikoModelIB5 ioncoaterfor4-5min andthenobservedinPhilipsModelXL30ESEM.
No.2需前处理的SEM样品制备程序
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
✧用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；
✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
✧用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20min。
✧用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。
✧临界点干燥。
✧镀膜，观察。
处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30型环境扫描电镜中观察。
IDoublefixation:
Thespecimenwasfirstfixedwith2.5%glutaraldehydeinphosphatebuffer（pH7.0）formorethan4hours;washedthreetimesinthephosphatebuffer,oncefor15min;thenpostfixedwith1%OsO4inphosphatebuffer（pH7.0）for1hourandwashedthreetimesinthephosphatebuffer.
IIDehydration:
Thespecimenwasfirstdehydratedbyagradedseriesofethanol（50%,70%,80%,90%,95%and100%）forabout15to20minutesateachstep,transferredtothemixtureofalcoholandiso-amylacetate（v:
v=1:
1）forabout30minutes,thentransferredtopureiso-amylacetateforabout1hour.Intheend,thespecimenwasdehydratedinHitachiModelHCP-2criticalpointdryerwithliquidCO2.
IIICoatingandobservation:
Thedehydratedspecimenwascoatedwithgold-palladiumandobservedinPhilipsModelXL30ESEM.
升级会员 