方法学验证方案.docx

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方法学验证方案

***含量测定

方法学确认方案

日期：

2016年1月

验证方案审查与批准

您下面的签字表明您已审阅此份验证方案并同意实施。

姓名

职务

签名

日期

起草人

姓名

职务

签名

日期

审核人

审核人

姓名

职务

签名

日期

批准人

1目的

对苦参膜中的含量测定检测方法进行确认，确保方法的可行性，以便为有效控制苦参膜的含量提供依据。

2范围

本方案适用于*****药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。

3验证机构与职责

3.1验证小组成员

姓名

所在部门

在验证中担任职务

签名

日期

组长

组员

组员

3.2职责

3.2.1验证小组组长职责

3.2.1.1保证确认方案及各种检查表的起草。

3.2.1.2保证在执行前完成对确认方案及各种检查表的审核和批准。

3.2.1.3负责对确认小组成员进行本方案的培训。

3.2.1.4保证完全按照确认方案实施。

3.2.1.5确保能及时发现偏差，并按照已经达成一致的偏差处理方法对其进行记录、纠正、调查和最终确认。

3.2.1.6确保确认报告的生成、审核和批准。

3.2.2QA职责

3.2.2.1执行前完成对确认方案及各种检查表的审核。

3.2.2.2负责确认过程的监控和检查，保证确认方案的实施，参与确认结果评价。

3.2.2.3参与确认偏差的调查、处理、和评估。

3.2.2.4确认过程中，如有变更，保证按《变更处理程序》执行。

3.2.3其它成员职责

3.2.3.1执行前确认确认方案已批准，并经过培训。

3.2.3.2按确认方案实施确认，收集、整理确认数据，完成确认记录和报告。

3.2.3.3参与确认偏差的调查和处理，确认通过偏差修订和解决方案。

3.2.3.4确认确认过程中的变更在实施前已经批准。

4定义

4.1线性：

指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

4.2准确度：

指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。

4.3重复性：

再规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价。

4.4中间精密度：

在同一个实验室，不同时间由不同分析人员或用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。

5参考文件

5.1药品生产质量管理规范（2010年修订版）

5.2药品生产验证指南

5.3中国药典（2015年版）二部

5.4《国家药品监督管理局国家药品标准》

5.5公司相关文件：

5.5.1苦参膜质量标准及检验规程（）

5.5.2验证管理（）

5.5.3变更控制操作规程（）

5.5.4偏差处理操作程序（）

5.5.5纠正措施与预防措施操作规程（）

5.5.62016年度验证总计划

6风险因素分析

风险评估将采用失效模式及影响（FMEA）的工具来评估和衡量方法参数失效后对产品分析结果的影响。

评估过程将参照公司质量风险管理的要求，风险等级为低、中、高级别的必须给出合理的建议措施，之后再次对建议的风险控制措施进行评估以确保风险的降低，分析、评估结果见附录1《风险评估表》。

7验证准备

7.1确保所有方法SOP是最新版本且经过批准，将检查结果记录在附录2《文件检查》内。

7.2确认参与验证的人员都经过此方案和相关SOP的培训，和识别所有签字和草签本方案任何数据表的人员。

将检查结果记录在附录3《培训检查和签名确认》内。

7.3确认验证过程中用到设备、计量仪器都是经过校验，并在有效期内，将检查结果记录在附录4《确认用仪器/仪表校准检查》内。

8检测方法的描述

8.1药品与试剂的准备

***对照品（中国药品生物制品检定院提供），***（为*****药业股份有限公司生产）；硅钨酸试液、碘化汞钾试液、苦味酸、氯仿、甲醇、浓氨、稀碘化铋钾试液、盐酸液（0.2mol/L）、氢氧化钠液（1mol/L）、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）、硫酸滴定液（0.05mol/L）、甲基红示液、磷酸、乙腈、无水乙醇。

8.2仪器分析条件

电子天平（FA2014）、超声池（KQ-300DE）、电热恒温水浴锅（DK-98-1）、高效液相（LC-10ATVP）

8.3检测方法

显色鉴别、色谱鉴别、酸碱滴定法、高效液相色谱法

8.4检测操作

8.4.1鉴别

8.4.1.1显色鉴别：

样品连续三批，A、B两位组员各取样品1号、样品2号约0.15g，分置三支试管中，加水2ml使溶解，分别加硅钨酸试液、碘化汞钾试液及苦味酸试液1～2滴，分别生成白色、淡黄色及黄色沉淀。

8.4.1.2薄层鉴别：

样品连续三批，A、B两位组员分别取本品0.1g，加甲醇10ml使溶解，超声提取15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；另取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中各含5mg的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，取上述三种溶液各2～3μl，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（5:

0.6:

0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。

8.4.2.3酸碱滴定法：

连续三批样品，两位组员分别取样品1、样品2，各10片，剪碎，取一片重两份，各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。

合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。

每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。

本品每片含总生物碱以****80.0%～110.0%。

相对偏差（dr%）不得超过0.6%

计算公式：

C1：

硫酸滴定液的实际浓度（mol/L）；

C2：

硫酸滴定液的理论浓度（mol/L）；

C3：

氢氧化钠滴定液的实际浓度（mol/L）；

C4：

氢氧化钠滴定液的理论浓度（mol/L）；

V1：

加入硫酸滴定液的体积（ml）；

V2：

消耗氢氧化钠滴定液的体积（ml）；

T：

标示量（26.44mg）；

：

该批20片苦参膜的平均重量（g）；

M：

使用苦参膜的量（g）。

8.4.2.4高效液相色谱法

8.4.2.4.1色谱条件与系统适用性试验：

用氨基键合硅胶为填充剂：

以乙腈-无水乙醇-3%磷

酸溶液（85:

7.5:

7.5）为流动相；柱温30℃，检测波长为220nm，流速1.0ml／min，理论塔板数按氧化苦参碱峰计算，应不低于5000。

6.2.2对照品溶液的制备：

取******对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:

15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液，摇匀，即得。

8.4.2.2供试品溶液的制备：

取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:

15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

6.2.4测定法：

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相

色谱仪，测定，即得。

本品每片含******不得少于22.0mg。

相对标准偏差不得过2%。

计算公式:

:

对照品进两针的平均峰面积；

:

对照品第一针峰面积；

:

对照品第二针峰面积。

9验证实施

9.1线性实验

目的：

在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度应符合规定。

9.1.1滴定法

9.1.1.1实验过程

同一人同时取同一批样品，各10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5，各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。

合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。

每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。

本品每片含总生物碱以氧化苦参碱（C15H24N2O）计，应为标示量的80.0%～110.0%。

相对偏差（dr%）不得超过0.6%。

9.1.1.2以样品滴定过程中消耗氢氧化钠的体积为横坐标，以样品含量为纵坐标，绘制回归方程。

9.1.1.3可接受标准（相关系数dr《0.6%）。

9.1.1.4记录：

将实验结果记录在《***滴定含量测定线性实验记录》内，见附录。

9.1.2高效液相

9.1.2.1对照品配制：

取***一瓶精密称取置25ml容量瓶中、***对照品两瓶精密称取置50ml量瓶中，加乙腈：

无水乙醇（85:

15）溶解至刻度。

分别精密量取氧化苦参碱0.5ml、苦参碱5ml；氧化苦参碱1ml、苦参碱10ml；氧化苦参碱2ml、苦参碱20ml，分别置25ml容量瓶中，加乙腈：

无水乙醇（85:

15）至刻度。

既得。

9.1.2.2样品制备：

取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:

15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

9.1.2.3测定法：

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本品每片****，不得少于22.0mg。

9.1.2.4以对照品的吸取量（峰面积）为横坐标，以样品含量（峰面积）为纵坐标，绘制回归方程

9.1.2.5可接受标准（相关系数RSD《2%）。

9.1.2.6记录：

将实验结果记录在《***高效含量测定线性实验记录》内，见附录5。

9.2重复性实验

目的：

在规定范围内，取同一批次的样品品，用5个测定结果进行评价，得到的结果RSD应符合要求。

9.2.1滴定法：

9.2.1.1实验过程

取同一批样品，10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。

合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。

每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。

本品每片含总生物碱以****80.0%～110.0%。

相对偏差（dr%）不得超过0.6%。

9.1.1.2可接受标准（相关系数dr《0.6%）。

9.1.1.3记录：

将实验结果记录在《***滴定含量测定重复性实验记录》内，见附录5。

9.2.2高效

9.2.2实验过程

9.1.2.1对照品配制：

对照品溶液的制备：

取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:

15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液，摇匀，即得。

9.1.2.2样品制备：

取同一批样品10片，剪碎并分别取样品1、样品2、样品3、样品4、样品5约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:

15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

9.1.2.3测定法：

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含苦参总碱以苦参碱（C15H24N2O）与氧化苦参碱（C15H24N2O2）的总量计，不得少于22.0mg。

9.1.2.4可接受标准（相关系数RSD《2%）。

9.1.2.5记录：

将实验结果记录在《***高效含量测定重复性实验记录》内，见附录5。

9.3中间精密度实验

9.3.1目的：

含量测定中，一个实验室内不同的人、在不同时间（通常是不同天）测定得到的结果RSD应符合要求。

9.3.1滴定含量

9.3.1.1实验过程

9.3.1.2两名实验人员分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g），加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。

合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。

每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。

9.3.1.3可接受标准（同一人实验结果RSD%≤2.0%；两人间的RSD%≤2.0%）

9.3.1.4记录：

将实验结果记录在《***滴定含量测定中间精密实验记录》内，见附录5。

9.3.2高效

9.3.2.1两名实验人员用同一批对照品分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g），置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:

15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

9.3.2.2测定法：

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含苦参总碱以苦参碱（C15H24N2O）与氧化苦参碱（C15H24N2O2）的总量计，不得少于22.0mg。

9.3.2.3可接受标准（同一人实验结果RSD%≤2.0%；两人间的RSD%≤2.0%）。

9.3.2.4记录：

将实验结果记录在《***高效含量测定中间精密度实验记录》内，见附5。

9.4含量测定准确度实验

9.4.1目的：

含量测定中，用已确定的方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，得到的结果RSD应符合要求。

9.4.2实验过程

精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约0.6g），分别置于圆底烧瓶中，分成三组，分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品2ml；向第二组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品5ml；向第三组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品7ml。

加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。

合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。

每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。

9.4.2.1测定法

将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。

9.4.2.2可接受标准（实验结果回收率98.0%～102.0%）。

9.4.2.3记录：

将实验结果记录在《***滴定含量测定准确度实验记录》内，见附录8。

9.4.3高效

9.4.3.1对照品制备：

对照品溶液的制备：

取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:

15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和35μg的溶液，摇匀，即得。

9.4.3.2供试品制备：

精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约0.6g），置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:

15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

分成三组（每组3份样品），分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品2ml；向第二组的每一份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品5ml；向第三组的每一份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品7ml。

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

9.4.2.3测定法

将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。

9.4.2.4可接受标准（实验结果回收率98.0%～102.0%）。

9.4.2.5记录：

将实验结果记录在《***效含量测定准确度实验记录》内，见附录8。

10偏差与变更

10.1验证偏差

当该方案的某一部分无法实施或实际情况无法达到可接受标准时，需要进行偏差报告。

当偏差出现时，首先要进行全面调查以确定该偏差是由什么引起的，之后再确定相应的解决措施。

将验证过程中产生的偏差记录在《偏差处理单》中，并作为验证记录附件。

10.2变更控制

所有在验证过程中产生的变更都需记录，确保所有的变更得到评估和批准，验证的结果达到预定的目的和要求。

将验证过程中产生的变更记录在《变更处理单》记录中，并作为验证记录附件。

11确认结果评定与结论

11.1验证小组负责对确认结果进行综合评审，做出确认结论。

11.2对确认结果的评审应包括：

11.2.1确认实施是否有遗漏？

11.2.2确认实施过程中对确认方案有无修改？

修改原因、依据以及是否经过批准？

11.2.3确认记录是否完整？

11.2.4确认试验结果是否符合标准要求？

是否需要进一步补充试验？

12附录目录

附录1风险评估报告

附录2文件检查

附录3培训检查和签名确认

附录4确认用仪器/仪表校准检查

附录5***滴定含量测定操作记录

附录5***高效含量测定操作记录

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