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荧光纳米球

《超分子化学与传感》课程作业

提高镧系荧光探针的发光效率：

与二氧化硅纳米球结合成为癌细胞的标记物

Increasingtheefficiencyoflanthanideluminescentbioprobes:

bioconjugatedsilicananoparticlesasmarkersforcancerouscells

姓名：

马骅

专业：

分析化学

导师：

袁景利

学号：

21307185

大连理工大学

DalianUniversityofTechnology

通过这篇文章我学习到了：

本文的中心是荧光纳米球的制备及表征过程。

有三个方面需要关注。

①将荧光探针包覆在SiO2纳米球中可以成倍的提高其发光能力，但是这种增强并不是与所包覆的荧光探针量成正比。

根据《超分子化学与传感》这门课程所学知识，可能是纳米球中荧光探针距离太近，导致淬灭现象发生。

②SiO2纳米球的制备方法。

首先，可以以共价键键合的方式将荧光探针包覆在纳米球中。

其次，可以将荧光探针在纳米球形成时一同包覆进去，但是这种方法制得的纳米球很容易泄露。

与老师做相关实验时也发现，在制备纳米球过程中，很容易在清洗过程中造成纳米球的泄露。

③表面活性基团的接入。

在纳米球的表面接入活性基团，如NH2、COOH等，可以使用纳米球标记目标物质，如蛋白等，这样可以用于生物免疫反应等特异性识别。

并且，活性基团的接入也不会影响纳米球的发光效果。

提高镧系荧光探针的发光效率：

与二氧化硅纳米球结合成为癌细胞的标记物

摘要：

利用油包水微乳液技术，已经可以将镧系双核螺旋探针嵌入到空的氨基修饰二氧化硅纳米球（NPS）中。

TEM显示二氧化硅包覆的镧系荧光探针[Ln2（LC2）3]@SiO2以及氨基修饰的二氧化硅包覆的镧系荧光探针[Ln2（LC2）3]@SiO2/NH2都是球形的并且其直径分别为55±5和90±10nm。

[Gd2（LC2）3]@NP配合物的三重态能级，~21800cm-1并没有因为与纳米球配合而减小，并且，这种处理方法对于光敏感的EuШ荧光探针是很有利的。

因此，[Ln2（LC2）3]@SiO2以及[Ln2（LC2）3]@SiO2/NH2都由于特异性的5D0→7FJ（J=0–4）能级跃迁而显示出红色的荧光并且后者的固有量子产率达到了28％。

为了检测氨基修饰的纳米球作为镧系荧光探针的效果，已经将其与生物素蛋白或者山羊抗老鼠抗体结合。

以时间分辨法特异性检测5D10单克隆抗体产生的MCF-7乳房癌细胞表明：

纳米球-抗体探针（NP-IgG）表现出了特殊的荧光信号，其信噪比达到了20%，这比荧光基团直接与抗体相连产生的探针的信噪比高。

另外，用链酶亲和素包覆的9孔板以及荧光纳米球-抗体探针来检测15ng/mL的5D10抗体，其信噪比达到了100。

介绍：

自从19世纪70年代出现了镧系时间分辨荧光检测法，镧系荧光检测成为了分析化学以及生物成像实验中普遍并且必须的的工具。

把荧光探针插入到纳米球中的好处在镧系荧光技术发展的前期就已经被发现。

现在，这种纳米探针在上转换磷光、多色可见红外标记等方面有了普遍的应用。

这些在生物科学方面的普遍应用已经有了大量的报道。

在过去的五年中，本实验室发明了双核镧系生物探针的理念，这种探针可以在室温以及生理pH值下自组装，并且这种探针热力学、动力学上都比较稳定。

其显著地优点在于将两种不同的镧系金属包裹于一个基底分子中，这种配合导致其具有双重效果，并且可以识别手型目标。

与苯咪唑吡啶的键和导致其可以产生多种特异性的衍生物，特别是可以提高探针的亲水性和实现生物性配合。

双核配合物[Ln2（LC2）3]（如图表1）荧光效果很好，并且可以认为对癌细胞或非癌细胞没有毒性（LD50＞500μM）。

这些探针通过内吞作用进入细胞，并且使细胞内质网可以在时间分辨荧光分析中显示出荧光。

与羧基键和得到的[Ln2（LC2（COOH））3]可以与癌细胞表面的抗生物素蛋白以及多种单克隆抗体进行高灵敏度和高特异性的识别。

Scheme1:

Ditopichexadentateligandsfortheassemblyofbinuclearlanthanidehelicates.

图表1：

六齿镧系双螺旋荧光探针的装配

目前，我们的实验对象是人类MCF-7乳腺癌细胞。

对其特异性识别的一种方法是通过识别5D10单克隆抗体来识别癌细胞表面的粘蛋白类抗原。

因此，这种抗体是由免疫球蛋白作为二次抗体修饰镧系配合物来进行特异性识别的。

本文中探讨了以二氧化硅纳米球代替[Ln2（LC2（COOH））3]能否提高灵敏度。

关于荧光纳米球的一些特殊性质也在本文中有所讨论。

实验部分：

实验试剂来自于Aldrich和FlukaA.G.，并且使用前没有经过处理。

[Ln2（LC2）3]是根据之前报道的合成方法合成的。

合成：

[Ln2（LC2）3]掺杂的纳米球（Ln=Eu,Gd）:

SiO2纳米球:

1.8ml正己醇与7.5ml环己烷混合，随后加入1.8mlTritonX-100，以及400μL水，80μL[Ln2（LC2）3]与Tris-HCl（pH7.4）的混合溶液，最后加入100μLtetraethyl-orthosilicate（TEOS）。

所有步骤在7分钟内完成。

配好的溶液搅拌30分钟并且加入60μL25%的氨水来促进TEOS的水解。

这一过程在室温下进行了24小时。

氨活化的SiO2纳米球:

方法一：

（两步法）SiO2先按照上述方法制备。

之后加入50μLTEOS，30分钟后加入10μLAPS。

混合溶液室温下搅拌24小时。

方法二：

（一步法）1.8μL正己醇与7.5mL环己烷混合，之后加入1.8mLTritonX-100，400μL水，80μL[Ln2（LC2）3]与Tris-HCl（pH7.4）的混合溶液，最后加入73μLTEOS和23μLAPS。

所得溶液搅拌30分钟后加入60μL25%的氨水。

这一反应在室温下进行48小时。

[Ln2（LC2）3]溶液的浓度从0（纯SiO2纳米球）到1和10mmol。

最大浓度的溶液用来做生物检测。

微乳液由于10mL的丙酮的加入而破坏，并且纳米球由于离心分离而分散开来。

将其用乙醇和水清洗数次，并且在空气中干燥。

纳米球在超声降解后达到之后实验所需的要求。

纳米球的平均产率在15mg左右。

与山羊抗鼠抗体特异性结合（NP-IgG）:

2mg氨基修饰的纳米球用PBS（磷酸缓冲溶液，pH=7.4）清洗两次，然后在2mL7%的戊二醛的PBS溶液中静置，在室温下搅拌1小时30分。

在用PBS清洗两次后，纳米球悬浮于1.5mL的PBS，并且加入0.5mL，1mg/mL的山羊抗老鼠抗体IgGAb（M8645,Sigma）。

溶液在室温下搅拌3小时，纳米球用PBS清洗三次，分散于淬灭剂中，并且反应30分钟。

纳米球用PBS清洗三次之后悬浮于PBS与0.05%BSA的混合溶液中，将其放置于4℃下待用。

与抗生物素蛋白结合（NP-advidin）：

与抗生物素蛋白的结合与山羊抗鼠抗体的结合步骤类似。

泄露实验：

多次PBS清洗以及分离后，并没有造成纳米球中荧光物质的泄露，即使在制备数月之后，也仅有少量的配合物泄露。

分析方法：

红外光谱分析记录4000-600cm-1的信号，使用配有普通衰减全反射采样器的Perkin-ElmerSpectrumOne检测器进行测试。

TEM在CIME-EPFL实验室测试，使用的仪器为PhilipsFEICM20显微镜。

吸收发射光谱以及寿命测试使用的仪器为Horiba-Jobin-YvonLtd生产的FluorologFL3-22spectrofluorimeter，其中，使用直径为2mm的石英管。

所有数据使用仪器的自带功能修正。

荧光延迟用Origi进行分析，并且证明为单指数函数。

量子产率在室温下使用Fluorolog荧光检测仪测量，使用自制的积分球，通过激发配体，采用绝对法测定量子产率。

使用装有MgO的毛细管来测试激发光的强度。

每个样品在不同的实验环境下测试数次。

测试的准确度达到了±10%。

生物素键和ELISA.

使用200μLDELFIA洗液清洗链酶亲和素覆盖的96孔板（DELFIAsyellowplate,AAAND-0005,PerkinElmer）。

将包含有100μL适当浓度生物素化的5D10抗体（10,5,1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005,0.001,0.0001and0.00001mgmL-1）的DELFIA缓冲溶液（DELFIAsassaybuffer,PerkinElmerWallacOy,Turku,Finland）加入其中，在室温下进行1小时的反应。

接着用洗液清洗三次，100μL探针（200μg/mLNP-IgG或5μg/mL生物配合的[Ln2（LC2（COOH））3]）和抗体被分别放入96孔板中反应1小时。

最后，用DELIFA清洗液清洗（5*200mL）后将荧光探针用PerkinElmer公司生产的Victor3多标记计数器检测（λex=340nm，延迟时间λem=615nm,0.4ms，记录时间0.4ms，测量周期1ms）。

计算的公式为DL=（3SD*c）/（Ic-I0），其中SD是标准偏差，c是产生可检信号的起始浓度，Ic是c浓度下的发射强度，I0是背景荧光，信噪比以（Imax-I0）/I0计算，其中Imax是最大荧光强度。

MCF-7细胞免疫荧光实验

山羊抗鼠抗体IgG标记的生物探针。

MCF-7细胞在8孔培养皿（ibidi，basel公司）上培养12小时，用PBS清洗培养皿三次后，细胞与0.4%的戊二醛在室温下培养15分钟。

用DELFIA清洗四次，之后用150μLDELFIA缓冲溶液室温下培养30分钟。

之后将最初的抗体细胞5D10（10μg/mL-1）加入孔板中，在室温下培养一小时。

用洗液清洗后，NP-IgG（400μg/mL-1）或Eu-IgG（10μg/mL-1）与细胞结合，并进行1小时的培养.最后，用200mL洗液清洗孔板四次，最后生物荧光探针用自制的时间分辨分析仪（使用NikonEclipse600显微镜和ORCA-ERCCD照相机：

λexc=340nm，λem=420nm,激发时间10μs，100ms延迟时间，门控时间600μs，30s测量周期）测试其荧光效果。

生物探针标记的生物素：

基本的步骤与上述步骤相同，除了5D10抗体用作一次抗体。

为了减少背景荧光（0.05%Tween20的PBS溶液或0.05%Tween20的碳酸钠溶液，pH=9.0）以及漂白作用（1%BSA的PBS溶液或1%Casein的Tris-HCl溶液，pH=7.4或5%FCS的PBS溶液或来自DAKO的抗体稀释液）的影响，分别用洗液进行清洗。

结果与讨论：

[Ln2（LC2）3]掺杂纳米球的合成与表征（Ln=Eu，Gd）

空的纳米球在含有双螺旋[Ln2（LC2）3]（Ln=Eu，Gd）、TritonX-100表面活性剂，正己醇助表面活性剂以及环己烷作为油相的水性溶液中制备，使用氨水来控制TEOS的水解作用。

为了合成氨基修饰的纳米球，虽然微乳液合成方法相同，但是加入硅烷试剂的方法有新的尝试

（1）“两步法”，APS在TEOS水解过程进行24小时后加入。

（2）“一步法”，TEOS和APS以VTEOS/VTEOS+APS=0.73的比例同时加入。

用红外光谱来表征纳米球表面的功能基团（如图1）。

与“一步法”相比，“两步法”制得的[Ru（bpy）3]2+掺杂纳米球显示出更加敏感的荧光发光，并且表面修饰了更多的氨基。

一种可以解释NPS中包含的染料较少的原因是“一步法”中APS产生的质子化的铵将[Ru（bpy）3]2+排除在外。

然而，在本实验中，“一步法”得到了相反的结果：

“两步法”制得的纳米球的分离效果微弱，并且当TEOS和APS同时加入之后EuIII纳米球表现出轻微的荧光，与[Eu2（LC2）3]@SiO2纳米球具有光物理参数上的相似性。

Fig.1IRspectraofEu-containingsilicaNPs.

图1：

包含有Eu的SiO2纳米球的红外图

与没有氨基修饰的纳米球相比，当纳米球表面被氨基修饰之后，在1570-1610cm-1和2800-3400cm-1显示出了δ（NH2）以及υ（N–H）特异性震动。

红外光谱分析所有的纳米球同样显示出Si-O（950-1200cm-1）和Si-C（760-790cm-1）的特征震动峰。

透射电子显微镜（TEM）分析显示出[Ln2（LC2）3]@SiO2以及[Ln2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球都呈球形分散，并且其粒径分别为55±5和90±10（如图2）。

Fig.2Temimagesof（A）[Ln2（LC2）3]@SiO2and（B）[Ln2（LC2）3]@SiO2/NH2

图2：

（A）[Ln2（LC2）3]@SiO2和（B）[Ln2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球的扫描电镜图

如果假设所有的双螺旋分子都被包含在了纳米球之中，以d表示纳米球的直径，μ表示合成产率，可以以如下的公式计算纳米球中包含的双螺旋分子数：

其中Nm表示原始溶液中的复合分子，Nnp是合成反应生成的纳米球数，c是溶液浓度，V是双螺旋分子溶液的体积。

NA是阿佛加德罗常数，mNP是质量，ρNP代表NPS密度（以二氧化硅记，1.95g/cm-3）.因此，我们发现1mmol的原始双螺旋溶液可以使大约540（纯SiO2球）和2380（氨基修饰纳米球）个双螺旋分子进入纳米球。

荧光效果：

配合物中心的荧光：

为了考察将荧光探针与纳米球配合能否影响有机配合物的性能，特别是三重态能级，我们合成了[Gd2（LC2）3]@SiO2和[Gd2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球。

两种固态纳米球显示出的磷光现象均显示出了宽锋，最大波长在约490nm，并且其特征为宽的振动峰。

并且，氨基修饰的纳米球的光谱在约410nm出现了肩峰，在增加了0.1ms延迟时间后没有消失（如图3）。

以0光子转移测得的三重态能级并没有改变，约21800cm-1，这一数值与报道的[Gd2（LC2）3]的~21900cm-1相同，这一数据证明[Gd2（LC2）3]与纳米球匹配，并没有改变其三重态能级，荧光延迟是单指数函数，且符合[Gd2（LC2）3]@SiO2和[Gd2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球的荧光寿命7.1

（2）和6.8

（2）ms，这一寿命比[Gd2（LC2）3]的8.7ms短了大约20%。

Fig.3Phosphorescencespectraofsolidstate[Gd2（LC2）3]@SiO2andGd2（LC2）3]@SiO2/NH2nanoparticles（λex=307nm,0.05msdelay,T=77K）.

图3：

[Gd2（LC2）3]@SiO2和Gd2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球的荧光光谱（λex=307nm,0.05ms延迟时间,T=77K）

金属中心的配合物所发荧光

包含[Eu2（LC2）3]的纳米球，其激发三重态能级与原始的EuШ双螺旋分子相类似（如图4）。

Fig.4（LEFT）Excitationand（RIGHT）emissionspectra（λex=330nm）ofsolidstatesamplesofpure[Eu2（LC2）3]andof[Eu2（LC2）3]-imbeddedsilicaNPsatroomtemperature.

图4：

室温下测得的纯[Eu2（LC2）3]和嵌入[Eu2（LC2）3]的纳米球的激发（左）和发射（右）光谱

并且由于电子的转移而在250-370nm显示出了宽锋，没有EuШ的特征f-f跃迁峰出现。

当被激发时，所有纳米球均表现出了较窄的，具有特征性的5D0-7FJ（J=0-4）跃迁，当使用氨基修饰金属配合物时，纳米球发出了微弱的蓝色荧光，波长在约400nm。

从荧光光谱来看，两种纳米球的配体场分裂仅有细微的不同，并且和母体[Eu2（LC2）3]配合物很相似。

另一方面，当双螺旋荧光分子与纳米球配合后，增加了5D0-7F2和5D0-7F4的跃迁，因此Itot/IMD增加了约20-40%（见表1）。

Table1Relativeintegratedintensitiesofthe5D0-7FJ（J=0–4）transitionsforsolidstatesamplesof[Eu2（LC2）3]andthecorrespondingdopedsilicaNPsat295K（λex=330nm）

表1：

固态[Eu2（LC2）3]以及相应的SiO2纳米球配合物在295K（λex=330nm）下5D0-7FJ（J=0–4）跃迁的相对积分强度

与[Eu2（LC2）3]相比，[Eu2（LC2）3]@SiO2和氨基修饰的纳米球的5D0荧光时间都要长，分别是2.50（3）和2.40

（2）ms（见表2）。

氨基修饰的纳米球之所以发光时间变短，是因为其直径变大。

纳米球的包裹并没有使双螺旋荧光物质的非辐射能量消耗减少，可能是因为双螺旋结构可以对金属荧光中心产生保护作用。

正如以上所述，[Eu2（LC2）3]@SiO2/NH2的纳米球“两步法”合成的纳米球荧光效果较弱，荧光时间较短，并且造成配体激发的发光量子产率QLEu下降到了6%。

方法二制备的[Eu2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球发光量子产率比母体双螺旋结构要长一些，纯的SiO2纳米球发光量子产率与母体相同。

Table2Photophysicalparametersforsolidstatesamplesof[Eu2（LC2）3]andthecorrespondingsilicaNPs（λex=330nm）

表2：

固态[Eu2（LC2）3]和SiO2纳米球的光物理参数（λex=330nm）a

由于f-f跃迁的强度较弱，无法估计固有量子产率，所以，根据以下公式估算其值：

其中AMD,0是恒定的（14.65s-1），以（Itot/IMD）来表示全部5D0-7FJ（J=0-4）的强度，并且以此来表示5D0-7F1跃迁。

抗射指标n无法用实验测得，但是可以设定为[Eu2（LC2）3]的特定值1.5，这个数值是处理有机发光配合物常用的值，由于n值的很少波动就会引起发光寿命的较大偏差，并且纳米球的抗射率也与纳米球的尺寸有关，因此使用n值时要格外小心。

然而，这些计算有助于了解一般的趋势。

与母体荧光探针相比，纳米球的发光时间要短10-22%。

其次是[Eu2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球，再次是[Eu2（LC2）3]@SiO2纳米球。

降低的原因是增强的QEuEu（达到了约60%）。

折射率（1.453/1.53）使得发射时间增加了10%，Itot/IMD的增大也使其增大了约30-40%（如表1）。

敏化作用的效果可以由以下公式计算：

考虑到[Eu2（LC2）3]@SiO2和[Eu2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球的母体是双螺旋体，表2中的数据显示出了轻微的增长。

另一方面，“两步法”制备的[Eu2（LC2）3]@SiO2/NH2纳米球的固有量子产率发生了较大的下降，可能的原因是能量转移的大幅度降低，配合物的激发能级可能被快速的非辐射转换而禁阻。

有趣的是，当使用[Gd2（LC2）3]@SiO2/NH2和[Gd2（LC2）3]@SiO2/NH2计算La的模型将QLEu以SiO2的值修正时，其值符合了QEuEu。

这表明，当配合物与SiO2纳米球复合时，阻止了配合物的非辐射能量消耗，类似于EuШ离子。

NPs的生物结合以及生物实验。

本实验的其中一个目的就是特异性识别癌细胞，为了达到这一目的，我们将氨基修饰的纳米球与抗生物素蛋白相结合，利用它进行抗生物素-生物素特异性识别。

然而，时间分辨图表现出了很强的背景荧光，说明荧光探针与MCF-7细胞非特异性结合。

尽管以不同的步骤清洗了多次，还是不能消除。

因此，将包含有Eu荧光探针的氨基修饰的纳米球直接与可以特异性识别5D10癌细胞的探针结合，进行了间接地免疫试验。

采取之前使用过的氨基活化过程，然后用3倍量的IgG与之反应，最后使得纳米球表面的抗体是单层覆盖的（图表2）。

表面的抗体数量可以用以下的公式计算：

S=（6/ρsd）（c）,其中，S是每克NP有多少mg蛋白，ρs是NP的密度（以二氧化硅的1.95g/cm记）,d是直径（μm），C是表面可以修饰的蛋白量，大约是3-2.5mg的BSA（MW=65kD）和牛IgG（MW=150kD）。

与相同抗体配合的[Eu2（LCOOH）3]也做了相关实验。

Scheme2BioconjugationofNH2-functionalizedsilicaNPswithgoatanti-mouseIgGantibody

图表2：

IgG包覆的氨基修饰SiO2纳米球

免疫分析测定使用链亲合素包覆的96孔板，以及增加浓度的生物素化的5D10mAb作为原始的抗体。

时间分辨荧光分析法表明，与纳米球配合的荧光探针比纯Eu-IgG探针的荧光效果好（如图5）。

但是，荧光纳米球的信噪比仅为100，而纯Eu-IgG探针达到了150。

所以对于α-5D10-B，NP-IgG和Eu-IgG的可检测的浓度分别是15和1.7ng/mL-1。

荧光纳米球信噪比较低的原因可能是由于纳米球与孔板之间非特异性的结合而是背景荧光增强。

另一个原因可能是由于纳米球的空间阻碍作用而使NP-IgG与老鼠单克隆抗体Ab5D10-B的结合受阻。

Fig.5AbsoluteemissionintensityofNP-IgGandEu-IgGasa

functionofthebiotinylated5D10antibodyconcentration.

图5：

NP-IgG和Eu-IgG标记的5D10生物素抗体的发射强度。

尽管本实验的结果不是很明显，但是NP-IgG在腺癌细胞MCG-7上实验表明，可以通过5D10单克隆抗体进行特异性识别。

空白试验中，在没有5D10抗体的条件下，纳米球与Eu-IgG进行了对比。

图6显示出了时间分辨法所测得的结果。

Fig.6Immunoluminescentdetectionof5D10AgonMCF-7cellsby5D10withtheNP-IgGprobe:

（A）brightfield,（B）luminescenceand（C）mergedimages.

图6：

使用NP-IgG特异性识别MCF-7癌细胞表面的5D10抗体的生物荧光测试。

（A）明场（B）荧光（C）合并图

结果表明，NP-IgG对与5D10一起培养的MCF-7细胞有特异性的识别效果。

信噪比的测量方法是在三张图片上找10个不同的店点进行测量。

与ELISA不同，纳米球的信噪比比单纯荧光探针高出了近20%。

（如图7）产生这一现象的原因可能是CCD实验的灵敏度较低，导致了对背景荧光的测量的不准确。

Fig.7LuminescenceintensityofNP-IgGandEu-IgGdetectionprobesasafunctionofthepresenceofthe5D10antigenonMCF-7cells.