双向电泳实验流程.docx

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双向电泳实验流程

双向电泳实验流程

●样品制备（Samplepreparation）

●固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）

●第一向等电聚焦（IEF）

●胶条的平衡（IPGstripequilibration）

●第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）

●凝胶的染色及检测（Detection/Staining）

●PDQuest软件分析（Softwareanalysis）

●质谱鉴定（Proteinidentification）

目　　录

第一章　　实验材料

1．1IPG预制胶条及载体两性电解质

1．2蛋白质定量试剂盒及其试剂

1．3蛋白样品制备试剂盒及其试剂

1．4化学试剂

1．5蛋白质Marker

1．6染色试剂

1．7注意事项

第二章　　SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1溶液的配制

2.2SDS-PAGE凝胶的配制

2.3操作方法

2.4注意事项

第三章　　双向电泳

3.1溶液配制

3.2操作步骤

3.3注意事项

附录1双向电泳完整的操作步骤

附录2　　聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置

附录3　　细胞样品的一般处理步骤

附录4　　组织样品的一般处理步骤

第一章实验材料

1．1IPG预制胶条及载体两性电解质

（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存，每包12根

项目规格货号原价（元）

IPG预制胶条pH3-10，7cm163-2000799

IPG预制胶条pH3-10，7cm，nonlinear（NL）163-2002799

IPG预制胶条pH4-7，7cm163-2001799

IPG预制胶条pH3-6，7cm163-2003799

IPG预制胶条pH5-8，7cm163-2004799

IPG预制胶条pH7-10，7cm163-2005799

IPG预制胶条pH3.9-5.1，7cm163-2028799

IPG预制胶条pH4.7-5.9，7cm163-2029799

IPG预制胶条pH5.5-6.7，7cm163-2030799

IPG预制胶条pH6.3-8.3，7cm163-2031799

IPG预制胶条pH3-10，11cm163-2014957

IPG预制胶条pH3-10，11cm，nonlinear（NL）163-2016957

IPG预制胶条pH4-7，11cm163-2015957

IPG预制胶条pH3-6，11cm163-2017957

IPG预制胶条pH5-8，11cm163-2018957

IPG预制胶条pH7-10，11cm163-2019957

IPG预制胶条pH3.9-5.1，11cm163-2024957

IPG预制胶条pH4.7-5.9，11cm163-2025957

IPG预制胶条pH5.5-6.7，11cm163-2026957

IPG预制胶条pH6.3-8.3，11cm163-2027957

IPG预制胶条pH3-10，17cm163-20071079

IPG预制胶条pH3-10，17cm，nonlinear（NL）163-20091079

IPG预制胶条pH4-7，17cm163-20081079

IPG预制胶条pH3-6，17cm163-20101079

IPG预制胶条pH5-8，17cm163-20111079

IPG预制胶条pH7-10，17cm163-20121079

IPG预制胶条pH3.9-5.1，17cm163-20201079

IPG预制胶条pH4.7-5.9，17cm163-20211079

IPG预制胶条pH5.5-6.7，17cm163-20221079

IPG预制胶条pH6.3-8.3，17cm163-20231079

IPG预制胶条pH3-10，18cm163-20321079

IPG预制胶条pH3-10，18cm，nonlinear（NL）163-20331079

IPG预制胶条pH4-7，18cm163-20341079

IPG预制胶条pH3-6，18cm163-20351079

IPG预制胶条pH5-8，18cm163-20361079

IPG预制胶条pH7-10，18cm163-20371079

IPG预制胶条pH3.9-5.1，18cm163-20381079

IPG预制胶条pH4.7-5.9，18cm163-20391079

IPG预制胶条pH5.5-6.7，18cm163-20401079

IPG预制胶条pH6.3-8.3，18cm163-20411079

IPG预制胶条pH3-10，24cm163-20421292

IPG预制胶条pH3-10，24cm，nonlinear（NL）163-20431292

IPG预制胶条pH4-7，24cm163-20441292

IPG预制胶条pH3-6，24cm163-20451292

IPG预制胶条pH5-8，24cm163-20461292

IPG预制胶条pH7-10，24cm163-20471292

IPG预制胶条pH3.9-5.1，24cm163-20481292

IPG预制胶条pH4.7-5.9，24cm163-20491292

IPG预制胶条pH5.5-6.7，24cm163-20501292

IPG预制胶条pH6.3-8.3，24cm163-20511292

（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存

项目货号原价（元）

Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，10ml163-11121704

Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，25ml163-11132463

Bio-Lyte3/5Ampholyte，20%，10ml163-11323275

Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，10ml163-11423713

Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，25ml163-11439287

Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，10ml163-11522984

Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，25ml163-11537540

Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，10ml163-11623569

Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，25ml163-11638187

Bio-Lyte7/9Ampholyte，40%，10ml163-11723479

Bio-Lyte8/10Ampholyte，20%，10ml163-11821912

Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，10ml163-11923275

Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，25ml163-11938114

（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存

项目货号原价（元）

100×ReadyStripBuffer，forpH7-10IPGStrips，1ml163-2093744

Bio-Lyte3/10Ampholyte，100×，1ml163-2094396

100×ReadyStripBuffer，forpH6.8-8.3IPGStrips，1ml163-2095566

100×ReadyStripBuffer，forpH5.5-6.7IPGStrips，1ml163-2096774

100×ReadyStripBuffer，forpH4.7-5.9IPGStrips，1ml163-2097545

100×ReadyStripBuffer，forpH3.5-5.1IPGStrips，1ml163-2098592

1．2蛋白质定量试剂盒及其试剂

项目货号报价（元）

ProteinAssayKit

，bovineγ-globulinstandard500-0001919

ProteinAssayKit

，BSAstandard500-0002919

ProteinStandard

，bovineγ-globulin，1bottle500-0005429

ProteinAssayDyeReagentConcentrate，450ml500-0006690

ProteinStandard

，bovineserumalbumin，1bottle500-0007365

QuickStartProteinAssayKitⅠ,Bradford法500-0201934

DcProteinAssayKitⅠ,bovineγ-globulinstandard500-01112281

DcProteinAssayKitⅡ，BSAstandard500-01122281

RCDCProteinAssayKit

，γ-globulin，Lowry法500-01213183

RCDCProteinAssayKit

，BSAstandard，Lowry法500-01223183

1．3蛋白样品制备试剂盒及其试剂

项目货号原价（元）

Ready-Prep2-DCleanupKit163-21302533

ReadyPrepSequentialExtractionKit163-21002969

Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-2101539

ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent1，1vial163-21021116

ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent2，1vial163-2103909

ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent3，1vial163-2104646

ReadyPrep2-DStarterKit163-21053250

ReadyPrep2-DStarterKitRehydration/SampleBuffer163-2106331

ReadyPrepStarterKitEquilibrationBuffer

，withDTT163-2107508

ReadyPrepStarterKitEquilibrationBuffer

163-2108498

E.coliProteinSample，lyophilized，2.7mg163-2110446

ReadyPrepOverlayAgarose，50ml163-2111287

ProteoMinerProteinEnrichmentSmallCapacityKit163-30063699

ProteoMinerProteinEnrichmentLarge-CapacityKit163-20075618

AurumSerumProteinMiniKit732-67011513

AurumAffi-GelBlueMiniColumns732-67081873

ReadyPrepProteinExtractionKit（Cytoplasmic/Nuclear）163-20894919

ReadyPrepProteinExtractionKit（MembraneI）163-20884919

ReadyPrepProteinExtractionKit（MembraneII）163-20842986

ReadyPrepProteinExtractionKit（Signal）163-20872815

1．4化学试剂

项目货号原价（元）

尿素Urea，250g161-0730222

尿素Urea，1kg161-0731685

AG501-X8（D）MixedBedResin142-64252771

CHAPS，1g161-0460390

TritonX-100，500ml161-0407421

DTT（Dithiothreitol），1g161-0610291

DTT（Dithiothreitol），5g161-0611731

Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-2101539

碘乙酰胺Iodoacetamide，30g163-21091429

溴酚蓝（BromophenolBlue），10g161-0404501

矿物油（MineralOil），500ml163-2129298

SDS，100g161-0301368

SDS，1kg161-03021991

Tris，500g161-0716813

Tris，1kg161-07191151

低熔点琼脂糖，25g161-31111360

甘氨酸，1kg161-0718713

甘氨酸，2kg161-07241671

丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g161-0101919

丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg161-01033411

丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg161-01071870

丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg161-01088514

甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g161-0200294

PDA（PiperazineDiacrylamide），10g161-02021902

PDA（PiperazineDiacrylamide），50g161-020317361

过硫酸氨（AmmoniumPersulfate），10g161-0700155

过硫酸氨（AmmoniumPersulfate），100g161-07541153

TEMED，5ml161-0800207

TEMED，50ml161-0801485

甘油Sigma

硫尿Sigma

1．5蛋白质标准品Marker

项目货号原价（元）

UnstainedSDS-PAGEStandards，highrange，200μl161-0303689

UnstainedSDS-PAGEStandards，lowrange，200μl161-0304689

UnstainedSDS-PAGEStandards，broadrange，200μl161-0317884

PolypeptideSDS-PAGEStandards，200μl161-0326692

PrestainedSDS-PAGEStandards，highrange，500μl161-0309689

PrestainedSDS-PAGEStandards，lowrange，500μl161-0305689

PrestainedSDS-PAGEStandards，broadrange，500μl161-0318800

PrecisionPlusStdUnstained，1ml161-03631168

PrecisionPlusStdDualColor，500ul161-03741080

2-DSDS-PAGEStandards，500μl161-03201457

IEFStandards，pIrange4.45-9.6，250μl161-03101621

1．6染色试剂

项目货号原价（元）

CoomassieBrilliantBlueR-250，10g161-0400413

CoomassieBrilliantBlueG-250，10g161-0406670

CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutionsKit161-04351440

CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutions，1L161-0436464

CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutions，4×1L161-04371856

CoomassieBrilliantBlueR-250DestainingSolutions，1L161-0438488

CoomassieBrilliantBlueR-250DestainingSolutions，4×1L161-04391952

Bio-SafeCoomassieStain，1L161-0786878

Bio-SafeCoomassieStain，5L161-07873493

SYPRORubyProteinGelStain，200ml170-31262226

SYPRORubyProteinGelStain，1L170-31255725

SYPRORubyProteinGelStain，5L170-313816744

SilverStainKit161-04433933

SilverStainPlusKit（质谱兼容）161-04492854

1．7注意事项

1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级，尽量选用进口试剂。

2.双向电泳中使用超纯水。

3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30℃，否则会发生蛋白氨甲酰化。

详细订货信息请致电:

-128

广州誉维生物科技仪器有限公司

Bio-Rad产品专员唐佩君

第二章SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1溶液的配制

30%聚丙烯酰胺贮液

丙烯酰胺150g

甲叉双丙烯酰胺4g

超纯水500ml

滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存

1.5mol/LTris碱pH8.8

Tris碱90.75g

超纯水400ml

用1mol/LHCl调pH至8.8，加超纯水定容至500ml，4℃冰箱保存。

0.5mol/LTris碱pH6.8

Tris碱12g

超纯水120ml

用1mol/LHCl调pH至6.8，加超纯水定容至200ml。

4℃冰箱保存。

10%SDS

SDS10g

超纯水100ml

混匀后，室温保存。

10%Ap

Ap0.1g

超纯水1ml（用时加水溶解）

溶解后，4℃冰箱保存

10×电泳缓冲液

（1×=25mMTris，192mMglycine，0.1%SDS，pH8.3）

Tris碱30g

甘氨酸144g

SDS10g

超纯水1L混匀后，室温保存

2×SDS-PAGE上样缓冲液

0.5MpH6.8Tris碱2.0ml

10%SDS4.0ml

甘油2.0ml

1%溴酚蓝0.05ml

超纯水定容至10ml

DTT0.154g（用时现加）

2.2SDS-PAGE凝胶的配制

参见附录1

2.3操作方法

1.将玻璃板洗净、晾干、固定。

2.按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。

将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用超纯水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。

3.配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。

4.将待分析鉴定的