平板分离技术与活菌计数实验报告.docx
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平板分离技术与活菌计数实验报告
平板分离技术与活菌计数实验报告
篇一：
微生物学大实验实验报告
微生物学大实验
实验题目：
土壤微生物的分离纯化与鉴定
一．实验目的：
1.巩固本学期所学的所有微生物实验操作技能。
2.再次强调无菌操作概念。
3.初步学习微生物鉴定纯化的方法和思路。
4.学会应用相关手册对微生物进行分类。
二．实验原理：
1.培养基的制备、消毒与灭菌：
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
2.微生物的分离与纯化：
自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
土壤是微生物生活的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是及其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可以从中分离到很多有价值的菌株。
本实验将采用平板划线分离法。
3.平板分离技术与活菌计数：
值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。
有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征
鉴定方能得到。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法主要有：
（1）平板划线分离法，
（2）稀释涂布平板法。
后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。
平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或多个细胞。
因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位（colony-formingunit，CFU）取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
4.分离菌株的鉴定：
微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。
不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。
不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。
所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：
第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。
另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
5.生理生化反应：
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪等不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。
胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差
异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。
IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。
吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反应：
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：
6.实验整体思路：
在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度进行涂板用于微生物的计数。
染色并镜检，利用形态学方法对微生物做一粗略的定位。
根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位。
根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位。
三．实验器材：
1.实验菌种：
大肠杆菌金黄色葡萄球菌
2.培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。
3.溶液和试剂：
50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
4.土样：
山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm土样。
5.仪器和其他用品：
普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。
四．操作步骤：
1.培养基的制备与分装。
（1）称量：
按培养基配方依次准确地称取药品。
（2）熔化：
在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。
（3）调pH：
用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。
（4）分装：
将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。
液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。
（5）加棉塞：
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。
试管先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。
2．无菌水的制备。
（1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
（2）用10ml吸管取9ml水于10支试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
3．器皿的准备。
（1）培养皿的包装：
每10套一包，用牛皮纸包扎。
（2）吸管的包装：
首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。
（3）玻璃涂布棒的包装：
方法同吸管的包装。
（4）枪尖的包装：
放入枪尖盒，牛皮纸包装。
4．高压灭菌。
（1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113℃，30min灭菌）。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
（2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。
培养基冷至50℃左右，倒平板。
5．微生物的分离与纯化。
（1）土壤稀释液的制备：
称取10g土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土壤，静置30min。
取10mL土壤原液于1号试管中，从中取1mL浸液于装有9mL无菌水的试管中，充分震荡后依次操作，将7支试管按稀释倍数分别记作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6号试管。
（2）涂布平板：
分别取0度，-2度和-5度的试管中的土壤浸出液0.2ml于细菌培养基平板上，用刮刀涂布均匀。
再分别取
0度和-3度稀释液0.2mL于准备好的霉菌培养基平板上，涂布均匀。
相同稀释度的浸液涂布3个平板。
（3）培养：
将细菌培养基平板置于37℃恒温箱培养24h，将霉菌培养基平板置于27℃恒温箱培养3d。
（4）平板计数及菌落描述：
将培养好的细菌进行平板计数（理想为每平板上不多
篇二：
实验十微生物稀释平板计数、划线分离
实验十微生物稀释平板计数、划线分离
一、目的要求
1.学习平板菌落计数的基本原理和方法。
2.熟练掌握倒平板技术、系列稀释原理及操作方法，平板涂布及划线分离方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
三、器材
大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基，1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4．5ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。
四、操作步骤
（一）稀释平板计数
1．编号：
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10、10、10各3套。
另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10、10、10、10、10、10。
2．稀释
用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。
然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。
另取一支吸管自10试管吸0．5ml放入10试管中，吸吹三次，……其余依次类推。
-1-2-1-1-2-3-4-5-6-4-5-6
3．取样
用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10、10、10的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。
4．倒平板
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。
5．计数
培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5
一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。
同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。
由10、10、10三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
平板菌落计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。
二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
（二）划线法分离
-4-5-6-4-5-6
图Ⅴ-3平板划线操作示意图
1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。
2、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平
板上划线（图Ⅴ-3）。
划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
常用的划线方法有下列二种：
图Ⅴ-4划线分离示意图
⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线（图Ⅴ-4，A）。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线（图Ⅴ-4，B）。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
五、实验报告
1．结果
将计数结果填入下表。
2．思考题
（1）为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？
（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？
为什么？
（3）同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？
为什么？
（4）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。
篇三：
微生物实验—三平板分离技术1
实验三微生物分离纯化技术
一、目的要求
掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作
二、实验材料
1、菌种
2、培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基
3、试剂和仪器：
无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅
2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿
三、实验原理
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。
最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。
四、实验过程
（1）稀释平板法
A每组取培养皿2只，即每个同学做1只。
先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
B另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边；
C取已熔化的在水浴锅中保温45－50℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37℃恒温培养。
（2）平板涂抹法
A每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。
在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
度、组别、班级。
B取已熔化的培养基倒入培养皿制成平板。
C凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2mL放在平板上。
D用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。
倒置于37℃条件下培养。
（3）平板划线法
A每组取无菌培养皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。
取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。
B凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－3或10－4）在平板上划线。
连续划线法：
将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。
C划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃温室培养。
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